Para começar, descongele rapidamente um estoque congelado de células SH-SY5Y no FBS. Suplementado com DMSO a 10% e diluído dez vezes com meio pré-aquecido. Em seguida, centrifugar as células e remover o sobrenadante.
Ressuspender o pellet celular em cinco mililitros de meio pré-aquecido e células de sementes em frasco T25. Para preparar as lamínulas revestidas com PDL, aplique 600 microlitros de solução de PDL de 50 microgramas por mililitro em cada poço de lamínulas de tampa com câmara estéril. O volume de PDL adicionado a cada poço varia de acordo com o tamanho do poço.
Incubar as lamínulas da tampa, ajustar a temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, retire a solução de PDL e lave a tampa três vezes com 1,8 mililitros de água destilada. Deixe a câmara revestida secar ao ar por duas horas.
Quando as células SH-SY5Y atingirem 80 a 90% de confluência, dissocia-as adicionando solução de tripsina. Neutralizar a tripsina adicionando um meio DMEM pré-aquecido. Centrifugar a suspensão celular e ressuspender o pellet em DMEM.
Conte as células em um contador de células automatizado. Em seguida, semeie as células a uma densidade de 1,5 vezes 10 a quarta células por centímetro quadrado no vidro de cobertura de câmara revestido de PDL. No primeiro e terceiro dia, substituir o meio por DMEM suplementado com cinco ou 2% de SFB, respectivamente, antimicótico antibiótico a 1% e 10 AR micromolar ou etanol 95% do mesmo volume de aditivo para servir como controle do veículo para diferenciação.
Prepare um estoque de PKMO em DMEM livre de fenil vermelho pré-aquecido suplementado com dois ou 10% de FBS dependendo do estado de diferenciação, 1% antimicótico antibiótico e 20 hepes milimolares. No sexto dia, lave as células duas vezes com meios de imagem e incube as células com a solução de PKMO a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Após a coloração, lave as células três vezes com meios de imagem pré-aquecidos.
Para a lavagem final, incubar as células por 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, substituir a lavagem final por meios de imagem pré-aquecidos contendo 20 hepes milimolares.
