Abra o software LightBox para aquisição de imagens. Para selecionar os conjuntos de laser e filtro, use parâmetros para um corante laranja selecionando o corante usado na coloração na lista de corantes. Usando uma visão geral, clique em Live para focar as células.
Quando as células estiverem em foco, ajuste as configurações de aquisição confocal. Em seguida, selecione o botão ROI retangular e crie uma região de interesse ao redor de uma mitocôndria de interesse clicando e arrastando para moldar a região. Para ajustar o fechamento do detector para depleção de emissão estimulada ou aquisição de posição, ao lado do menu geral, selecione o menu de fechamento ou clique e segure para adicionar o menu à exibição.
Para aquisição de stead, ajuste o laser de excitação para 15 a 20% e o laser de depleção de ponto para 20 a 25% com acúmulos de 10 linhas. Use um tempo de permanência de pixels de quatro microssegundos e um tamanho de pixel de 20 a 25 nanômetros. Execute o lapso de tempo selecionando o menu suspenso de tempo e, em seguida, definindo o número de iterações como cinco e um intervalo de tempo de 25 ou 30 segundos.
Uma pilha Z pode ser tomada usando a opção de volume e ajustando a faixa de volume Z desejada e o tamanho do passo. Abra o software de deconvolução de imagem de stead para deconvoluir imagens de stead raw com o algoritmo do software. Depois de garantir que os parâmetros microscópicos estejam corretos, selecione o botão expresso e defina o tipo de deconvolução muito rápido, padrão, agressivo ou conservador para diferentes graus de poder de deconvolução.
Execute a deconvolução. Salve as imagens no formato ICS2. Na imagem J, clique no arquivo e abra para abrir os arquivos ICS2 do software de deconvolução.
Selecione plug-ins e, em seguida, segmentação seguida de segmentação Weka treinável para abrir as imagens estáveis descomplicadas no plug-in de segmentação Weka treinável. Nas configurações de segmentação, selecione os recursos de desfoque gaussiano, projeções de membrana e filtro sobel. Rotule uma classe como cristae e a outra como fundo.
Em seguida, desenhe uma linha sobre a estrutura a ser atribuída a qualquer classe. Em seguida, selecione o botão Adicionar no lado direito para cristae ou fundo. Em seguida, selecione o botão classificador de trem no lado esquerdo para gerar um mapa com base nas informações fornecidas ao plugin.
Clique no botão salvar classificador para salvar as configurações do classificador para segmentação futura. Use o mapa de probabilidade cristae para limitar a imagem na imagem J para gerar uma máscara binária e, em seguida, vá para analisar e, em seguida, analise partículas. Finalmente, desenhe uma linha multiponto, ajuste a espessura da linha para vários pixels de largura e spline a linha para se ajustar às mitocôndrias.
Neste estudo, imagens de mitocôndrias em células SH-SY5Y indiferenciadas de ácido retinóico diferenciadas com imagens de lapso de tempo, como mostrado. As imagens de pontos contorcidos podem ser usadas para determinar a periodicidade das cristas em uma determinada área e medidas de tamanho e forma das cristas.
