Para começar, centrifugar FBS durante a noite em uma ultracentrífuga a 110.000 G e quatro graus Celsius para remover os sEVs endógenos. Esterilize o sobrenadante filtrando-o através de uma membrana de ultrafiltração de 0,2 mícron para produzir SFB livre de sEVs. Em seguida, em uma placa de cultura de 150 milímetros, placa cerca de 3 vezes 10 para o sétimo macrófagos derivados da medula óssea imortalizados em 20 mililitros de meio de cultura DMEM.
Incubar o prato a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono durante a noite antes de coletar os sEVs dos macrófagos. No dia seguinte, após o descarte do meio, lavar as células com solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Substitua o meio por DMEM contendo soro fetal bovino livre de 10%sEVs antes de incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Com base nas necessidades do experimento, colete e transfira o sobrenadante das células para tubos de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar os tubos a 300 G por 10 minutos para remover as células. Transfira o resultado em sobrenadante de cada tubo para um novo tubo centrífugo de 50 mililitros e descarte o pellet.
Desta vez, centrifugar o sobrenadante a 2000 G por 10 minutos para remover as células mortas. Em seguida, transfira o sobrenadante para novos tubos centrífugos de alta velocidade e descarte os pellets. Em seguida, para remover detritos e microvesículas, centrifugar o sobrenadante obtido a 10.000 G por 30 minutos usando uma centrífuga de alta velocidade.
Transfira o sobrenadante resultante para novos tubos de ultracentrífuga adicionando 35 mililitros em cada tubo e descartando os pellets. Centrifugar os tubos ultracentrífugos em uma centrífuga de rotor de caçamba oscilante a 110.000 G por 70 minutos antes de descartar o sobrenadante. Lave o pellet enriquecido com sEVs brutos resultante com um mililitro de PBS.
Novamente, adicione um mililitro de PBS ao pellet lavado em um dos tubos e misture pipetando continuamente. Transfira o mililitro da suspensão PBS resultante para outro tubo contendo o pellet e repita o mesmo até que todos os pellets nos tubos sejam misturados por pipetagem. Transfira o mililitro resultante de PBS rico em sEVs para um novo tubo de ultracentrífuga.
Em seguida, centrifugar o novo tubo em uma ultracentrífuga de mesa a 110.000 G por 70 minutos. Depois de descartar o sobrenadante, lave o pellet enriquecido com sEVs brutos resultante com 100 microlitros de PBS. Adicione 1,2 mililitros de solução de preparação de proteínas num tubo de proteína padrão para dissolver os 30 miligramas de BSA presentes no mesmo.
Diluir a solução padrão de proteína resultante com PBS para reduzir sua concentração de 25 para 0,5 miligramas por mililitro. Adicione oito volumes diferentes da solução padrão de proteína diluída em poços de uma placa de 96 poços e eleve o volume para 20 microlitros em cada poço usando PBB. Adicionar 18 microlitros de tampão de lise HEPES aos poços de amostra, seguido da adição de dois microlitros das amostras de sEVs.
Em seguida, adicione 200 microlitros de solução de trabalho BCA preparada de acordo com as instruções do fabricante em cada poço. Deixe a placa descansar à temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos. Finalmente, meça a absorbância a 562 nanômetros usando um leitor de microplacas.
Calcular o teor de proteína total nos sEVs usando os resultados obtidos. As imagens de microscopia eletrônica de transmissão dos sEVs isolados mostraram uma morfologia típica de copo. A análise de rastreamento de nanopartículas mostrou que os sEVs isolados estavam concentrados principalmente em 136 nanômetros.
O Western blot mostrou que as sEVs isoladas foram significativamente enriquecidas com marcadores de sEVs, incluindo CD9, beta-actina e TSG101. O marcador reticulado endoplasmático GRP94 só foi detectado no lisado de células inteiras. Os resultados indicaram que o método empregado produziu sEVs com alto nível de pureza.
