Para começar, lave as pequenas vesículas extracelulares isoladas ou SEVs duas vezes por ultracentrifugação a 110.000 G e quatro graus Celsius por 70 minutos. Ressuspender as vesículas em 500 microlitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Em seguida, adicione cinco microlitros de inibidor de protease 100X a ele.
Submeter a amostra a esmagamento ultra-sônico a 40 watts por 10 minutos, com tempo ultrassônico de três segundos e tempo de intervalo de cinco segundos. Centrifugar a mistura triturada a 13.700 G durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Ao sobrenadante obtido, adicionar ditiotreitol a uma concentração final de 50 milimolares.
E incubá-lo em banho-maria a 56 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione 50 microlitros de iodoacetamida molar ao sobrenadante. E deixe reagir à temperatura ambiente por 20 minutos no escuro.
Centrifugar a mistura a 13, 700 G e quatro graus Celsius durante 15 minutos. E transfira o sobrenadante contendo o extrato peptídico bruto para um tubo de ultracentrífuga de 10 quilodaltons. Retire a proteína do peptídeo bruto centrifugando o tubo de ultrafiltração a 13, 700 G e quatro graus Celsius por uma hora.
Secar o efluente coletado em um concentrador centrífugo a vácuo a 45 graus Celsius. Para a dessalinização, use água pura de grau de espectrometria de massa como solvente para todos os reagentes. Primeiro, dissolver os peptídeos secos em 100 microlitros de ácido trifluoracético a 0,1% ou TFA, e mantê-lo de lado.
Em seguida, adicione 100 microlitros de acetonitrila pura a cada coluna de dessalinização. Centrifugar as colunas a 400 G durante três minutos à temperatura ambiente e eliminar o efluente. Em seguida, adicione 100 microlitros de acetonitrila a 50% por coluna de dessalinização e repita a centrifugação como mencionado anteriormente antes de descartar o efluente.
Em seguida, adicione 100 microlitros de TFA 0,1% a cada coluna de dessalinização antes de centrifugar, como mencionado anteriormente. Mais uma vez, descarte o efluente. Agora, pipete os peptídeos do dessal na coluna de dessalinização.
Centrifugar as colunas como mencionado anteriormente para carregar a amostra. Adicione o efluente recuperado de volta à coluna de dessalinização para repetir o carregamento. Em seguida, adicione 100 microlitros de TFA 0,1%.
Centrifugar como mencionado anteriormente, e descartar o efluente. Finalmente, adicionar 50 microlitros de acetonitrila a 50% contendo 0,1% de TFA ao peptídeo na coluna de dessalinização. Após a centrifusão, como mencionado anteriormente, coletar o efluente em um novo tubo de centrífuga grau espectrometria de massa.
