Para começar, borrife completamente o camundongo macho C57 preto 6J sacrificado de 10 semanas com etanol 70%. Usando pinças, remova a pele do membro posterior e disseque todos os músculos dos membros ao redor do fêmur, tíbia e fíbula. Coloque os músculos dos membros colhidos em um tubo de dois mililitros contendo um mililitro de tampão de isolamento muscular.
E usando tesoura, pique os músculos colhidos. Transfira a suspensão do músculo picado para um tubo de 50 mililitros contendo 18 mililitros de tampão de isolamento muscular. Feche bem o tubo, sere-o com filme de laboratório e coloque-o horizontalmente em banho-maria.
Após 30 minutos, adicionar cinco miligramas de colagenase tipo I e manter o tubo por mais 30 minutos. Após pipetar a suspensão muscular para cima e para baixo 10 vezes, centrifugar e descartar o sobrenadante, deixando cinco mililitros do meio no tubo. Pipetar a suspensão nos filtros de células sucessivos e coletar o fluxo para o tubo de 50 mililitros.
Centrifugar a suspensão e descartar o sobrenadante até que restem apenas 100 a 200 microlitros no tubo. Ressuspenda o pellet em dois mililitros de tampão de lise de hemácias e incube no gelo por três minutos. Centrifugar novamente e remover o sobrenadante do tubo usando uma pipeta de 20 a 200 microlitros.
Ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão FACS frio e coloque o tubo sobre gelo. Após a remoção de 10 microlitros de suspensão celular para o controle negativo, centrifugar os 90 microlitros restantes e descartar o sobrenadante antes de incubar as células com 400 microlitros de coloração de viabilidade fixável diluída em DMEM sem soro por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, adicione 100 microlitros de tampão FACS e inverta suavemente o tubo três vezes.
Centrifugar novamente e adicionar 100 microlitros de mistura de anticorpos primários no tubo. Após 30 minutos de incubação no escuro, centrifugar e descartar o sobrenadante. Em seguida, adicione 500 microlitros de PBS para lavar as células.
Centrifugar novamente e remover o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 500 microlitros de tampão FACS. Transfira a suspensão para um tubo de cinco mililitros. Vórtice brevemente a suspensão celular antes de processá-la em um citômetro de fluxo.
Coletar as células selecionadas no tubo revestido de cinco mililitros contendo tampão FACS. 75% das células mononucleadas identificadas com base em seu tamanho e granularidade foram negativas para o marcador de coloração de viabilidade fixável, levando a uma média de 34,3% de células vivas. Cerca de 3% das células vivas isoladas foram negativas para marcadores específicos de monócitos, endotélios, leucócitos e eritroides.
Essas células negativas foram então selecionadas de acordo com a expressão dos marcadores CD34 e ITGA7. Um gating final para CXCR4 foi realizado para selecionar células satélites putativas. E das células ITGA7-positivas para CD34, 80% foram positivas para CXCR4.
