Centrifugar as células satélites isoladas do FACS e descartar o sobrenadante. Lave as células com um mililitro de PBS, centrífuga, e incube-as em um mililitro de tampão de extração nuclear frio sobre gelo por 20 minutos. Adicione 20 microlitros de esferas magnéticas revestidas de Concanavalina A em um tubo de 1,5 mililitro contendo 850 microlitros de tampão de ligação a frio.
Em seguida, usando um rack magnético, lave as contas duas vezes com um mililitro de tampão de ligação a frio e deixe que as contas se acumulem ao lado do tubo no rack por cinco minutos antes de ressuspendê-las suavemente em 300 microlitros de tampão de ligação a frio. Em seguida, centrifugar os núcleos e ressuspendê-los suavemente em 600 microlitros de tampão de extração nuclear. Em seguida, misture 600 microlitros de núcleos extraídos com 300 microlitros de polpa de contas de Concanavalina A e incube a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Depois de remover o sobrenadante usando um rack magnético, ressuspenda os núcleos ligados ao talão com um mililitro de tampão de bloqueio frio. Novamente, remova o sobrenadante e lave os núcleos ligados ao talão duas vezes com um mililitro de tampão de lavagem a frio. Separe o sobrenadante, ressuspenda suavemente os complexos de esferas do núcleo com um anticorpo primário específico e incube a quatro graus Celsius durante a noite com agitação suave.
No dia seguinte, retire o sobrenadante e lave os núcleos ligados ao talão antes de ressuspender em 100 microlitros de tampão de lavagem a frio. Adicionar 100 microlitros de proteína A-nuclease microcócica diluída aos 100 microlitros de núcleos ligados a contas e incubar a quatro graus Celsius por uma hora com agitação. Após a incubação, remova o sobrenadante e lave os núcleos ligados ao cordão duas vezes antes de ressuspendê-los em 150 microlitros de tampão de lavagem a frio.
Em seguida, adicione três microlitros de cloreto de cálcio 100 milimolares, misture rapidamente mexendo e incube no gelo por 30 minutos. Pare a reação adicionando 150 microlitros de tampão de parada e incube a 37 graus Celsius por 20 minutos. Centrifugar as amostras e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga, descartando o pellet e as contas.
Em seguida, adicione três microlitros de dodecil sulfato de sódio a 10% e 2,5 microlitros de 20 miligramas por mililitro de proteinase K.Mix por inversão e incube por 10 minutos a 70 graus Celsius. Em seguida, adicione 300 microlitros de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico e vórtice antes de transferir para tubos de bloqueio de fase de dois mililitros. Centrifugar e adicionar 300 microlitros de clorofórmio ao mesmo tubo.
Centrifugar novamente e coletar o sobrenadante em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione um microlitro de glicogênio, depois 750 microlitros de etanol 100% e deixe o DNA precipitar durante a noite a menos 20 graus Celsius. No dia seguinte, granule o DNA por centrifugação, depois lave o pellet com um mililitro de etanol 100% e centrífugo duas vezes antes de remover o etanol residual com uma pipeta.
Seque o pellet ao ar por cinco minutos e ressuspenda-o em 25 microlitros de tampão tris-EDTA. O H3KME2 e o H3K27AC foram enriquecidos ao redor do TSS de PAC7, ITGA7, LAM2, CXCR4 e VCAM1. No entanto, H3K4ME2 e H3K27AC não foram enriquecidos com ITGAM, PTPRC, PECAM, CKM ou MHY3.
Quase nenhum sinal foi obtido com a amostra de IgG. HOMER conhecido análise de motivos picos de RA e células satélites e porcentagem de regiões alvo são mostrados. A análise da Seeker revelou quase 500 picos com uma pontuação de pico superior a 50, com mais de 200 deles com uma pontuação superior a 100.
