Para iniciar o ensaio usando o agonista do receptor plaquetário, Collagen-Related Peptide Cross-Linked ou CRPXL, diluir uma quantidade apropriada do estoque de CRPXL no tampão de ensaio para uma concentração adequada para induzir a máxima agregação plaquetária. A solução resultante será doravante denominada padrão. Em seguida, a partir das mesmas concentrações preparadas mais elevadas, efectue sequencialmente diluições em série duas vezes tanto para o reagente padrão como para o reagente de ensaio.
Prepare uma série de diluição de seis a oito pontos para o teste e o padrão no buffer de ensaio que gere respostas de agregação de 100% até 0%Quando o plasma rico em plaquetas, ou PRP, estiver pronto para uso, adicione uma alíquota de PRP na cubeta de agregometria de transmissão de luz. Deixe as amostras aquecerem a 37 graus Celsius nos poços de retenção por alguns minutos. Depois de devidamente aquecidos, coloque as cubetas no agregômetro para começar a registrar os vestígios.
Com agitação constante, adicione o agonista e registre os dados. Efectuar a recolha de dados para cada diluição preparada do padrão e do reagente de ensaio. Use o Graphpad Prism, ou qualquer pacote de software adequado, para verificar se as curvas de concentração para o padrão e o teste são paralelas.
Insira os dados de forma que o eixo x contenha as concentrações, e o eixo y contenha as respostas indicadas pela porcentagem de agregação máxima ou pela área sob a curva. Em seguida, transforme os valores de concentração para os logaritmos correspondentes, ou concentração logarítmica. Selecione a regressão não-linear a partir das funções de análise e use a equação para estimulação dose-resposta.
Selecione o agonista de log versus a inclinação da variável de resposta e use um ajuste de três ou quatro vias, dependendo do que for melhor para os dados. Determine se as curvas geradas são paralelas clicando na guia comparar e comparando os conjuntos de dados. Certifique-se de que a inclinação e as assíntotas do ensaio e as curvas padrão são equivalentes.
Se essas condições forem atendidas, proceda ao cálculo da potência, ou CE50, usando ajuste de curva de regressão não linear. Calcular a potência relativa dividindo o valor CE50 da norma pelo valor do ensaio. Ajustar a concentração mássica por volume do reagente de ensaio para ter em conta a diferença de potência em relação à norma.
Os traços de agregação plaquetária para o padrão e o reagente teste revelaram a diferença entre as duas respostas de agregação. A 0,075 microgramas por mililitro, houve uma resposta clara ao padrão, enquanto, para o teste, a concentração correspondente não mostrou resposta. Os valores de CE50 do reagente padrão e teste foram calculados traçando-se a curva de concentração-resposta.
