Para começar, tome as vesículas sub-mitocondriais de levedura preparadas e centrifugue as vesículas geradas e permanecendo intactas mitocôndrias a 20.000 G por 20 minutos a quatro graus Celsius. As mitocôndrias intactas formaram a pelota, enquanto as vesículas permanecem no sobrenadante. Em seguida, transfira o sobrenadante para tubos de ultracentrifugação frescos.
Coloque uma almofada de 0,3 mililitros de solução de sacarose 2,5 molar no fundo do tubo usando uma seringa de um mililitro equipada com uma cânula e centrífuga a 118.000 G por 100 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, as vesículas aparecerão como um disco no topo da almofada de sacarose. Descarte aproximadamente 90% do sobrenadante.
Para colher as vesículas concentradas, ressuspendê-las no tampão restante, incluindo a sacarose de 2,5 molares por pipetagem. Transfira a suspensão para um homogeneizador Dounce gelado e homogeneize a suspensão usando um oleiro de politetrafluoretileno com pelo menos 10 cursos. Em seguida, prepare um gradiente de passo de 11 mililitros com cada camada contendo 2,2 mililitros de solução de sacarose.
Calcular a concentração de sacarose utilizando esta fórmula. Adicione a maior concentração de sacarose ao tubo de centrifugação e coloque-o a menos 20 graus Celsius até que a camada esteja completamente congelada. Medir a concentração de sacarose das amostras utilizando um refratómetro.
Se um refratômetro não estiver disponível, suponha que a concentração de sacarose seja de 2 molares. Para ajustar a concentração de sacarose a 0,6 molares, adicionar o coquetel apropriado de MOPS, E-D-T-A, P-M-S-F e inibidor de protease em pH 7,4. Carregar cuidadosamente as amostras no gradiente de sacarose para evitar a perturbação do gradiente.
Centrifugar as vesículas a 200, 000 G e quatro graus Celsius durante 12 horas. Se possível, defina aceleração e desaceleração lentas para evitar a interrupção do gradiente. Em seguida, colete o gradiente de cima para baixo em frações de 700 microlitros, usando uma pipeta de um mililitro.
Resultando em 17 frações, o que fornece uma resolução suficiente. Em seguida, realizar duas precipitações de ácido tricloroacético executadas sequencialmente, adicionando 200 microlitros de ácido tricloroacético a 72% às frações individuais e misturando até que a solução esteja homogênea. Incubar as frações por 30 minutos em gelo e pellet as proteínas precipitadas centrifugando a 20.000 G e quatro graus Celsius por 20 minutos.
Descarte o sobrenadante. Adicionar 500 microlitros de solução de ácido tricloroacético a 28%. Misture bem e repita a etapa de centrifugação.
Por fim, analise as frações por SDS-PAGE e immunoblotting. A importância da sonicação leve é apresentada aqui. O marcador de membrana externa mitocondrial Tom40 foi enriquecido nas frações iniciais de baixa densidade e esteve virtualmente ausente nas frações posteriores.
O marcador de membrana interna mitocondrial Tim17 foi concentrado em frações de alta densidade. Em contraste, a proteína do sítio de contato Mic60 acumulou infrações de concentração intermediária de sacarose, indicando a geração bem-sucedida e subsequente separação das várias vesículas de membrana. Em contraste, com condições de sonicação mais severas, o marcador de membrana externa mitocondrial Tom40 pôde ser detectado em frações mais baixas do gradiente.
Além disso, houve uma quantidade significativa de infrações de Tim17 de densidade intermediária.
