Comece colocando as carcaças de larvas de drosophila marcadas com anticorpos em 0,2% PBST em uma lâmina de vidro. Ajustado sob o microscópio estéreo, garantindo que a superfície interna da carcaça da larva esteja voltada para cima. Absorva o excesso de solução PBST usando um toalhete.
Em seguida, adicione delicadamente uma gota de meio de montagem Anti-Fade. Em seguida, coloque uma tampa deslizante na lâmina cobrindo as larvas dissecadas lenta e suavemente, evitando a formação de bolhas. Fixe a tampa no lugar aplicando esmalte nas bordas.
Armazene a lâmina em um local escuro para minimizar a atenuação fluorescente. Para a aquisição das imagens, utilizar o microscópio confocal de varredura a laser com objetiva de imersão em óleo 63x. Em seguida, ajuste o comprimento de onda e a potência do laser para se adequar melhor aos requisitos do experimento.
Para identificar as junções neuromusculares e capturar imagens do músculo quatro no segmento A três, selecione um laser de 488 nanômetros para ativar a tubulina alfa ou Futsch e 546 nanômetros para ativar a trilha de imagem HRP. Modifique os parâmetros para obter um tamanho de quadro de 1, 024 por 1, 024 pixels, um zoom digital de 1,0 e um intervalo de imagem de 0,8 micrômetros. Para visualizar os microtúbulos no músculo, capture imagens do músculo dois nos segmentos A três a A cinco, pois ele tem menos ramos traqueais.
Escolha um laser de 488 nanômetros para ativar a tubulina alfa e um laser de 633 nanômetros para ativar a trilha de imagem T3605. Ajuste os parâmetros de imagem para um tamanho de quadro de 1, 024 por 1, 024 pixels, um zoom digital de 2,0 e um intervalo de imagem de 0,4 micrômetros. As organizações dos microtúbulos pré e pós-sinápticos da junção neuromuscular foram marcadas com anti-alfa tubulina.
A coloração de Futsch refletiu a abundância de microtúbulos estáveis nos neurônios pré-sinápticos. A diminuição da intensidade de sinal do anti-Futsch foi observada quando a proteína Katanin 60 cortante dos microtúbulos foi superexpressa nos neurônios pré-sinápticos. A intensidade de coloração do tronco axonal foi mais forte que a dos ramos.
As mutações de Katanin 60 resultaram no aumento das alças dos microtúbulos. A superexpressão de Katanin 60 causou fragmentos curtos de microtúbulos dentro dos botões terminais. A coloração com alfatubulina demonstrou uma rede clara de microtúbulos ao redor do núcleo.
As células musculares tiveram uma intensidade microtubular perinuclear significativamente aumentada e exibiram feixes mais fortes no mutante Katanin 60. A superexpressão resultou na fragmentação das fibras dos microtúbulos.
