Para começar, tome um mililitro de uma cultura de células de levedura de brotamento de fase intermediária, expressando HyPer7 direcionado para mitocôndrias. Centrifugar as células a 6.000 G por 30 segundos e retirar o sobrenadante, deixando de 10 a 20 microlitros no tubo. Ressuspenda o pellet de célula misturando-o suavemente com o meio residual usando uma micropipeta.
Em seguida, use um soprador de ar ou tecido sem fiapos para limpar uma lâmina de microscópio de vidro e adicione 1,8 microlitros da suspensão celular à lâmina. Finalmente, cubra as células com tampa de vidro número 1.5, abaixando-a lentamente em um ângulo para evitar a introdução de bolhas. Em seguida, coloque a lâmina no palco do microscópio.
Para obter imagens das células, configure as condições de aquisição para garantir um sinal detectável e resolução aceitável em cada canal de fluorescência. Por exemplo, em um microscópio confocal de disco giratório com uma câmera sCMOS use binning 2x2, 20 a 40% de potência do laser e exposição de 200 a 600 milissegundos. Em seguida, examine o histograma da imagem.
Em uma imagem de 12 bits, verifique se o intervalo dinâmico total dos valores de pixel é de pelo menos várias centenas de níveis de cinza sem saturação. Além disso, certifique-se de que o alcance seja uma ordem de magnitude maior do que o nível de ruído. Para calcular o nível de ruído, meça o desvio padrão dos valores de pixel em uma área livre de células de uma imagem.
Em seguida, colete imagens de lapso de tempo sem atraso entre as aquisições para avaliar os efeitos das condições de imagem na estabilidade do sinal e no estresse oxidativo nas mitocôndrias. Usando o software de aquisição do microscópio ou ImageJ, meça o valor médio de pixel em cada canal de fluorescência para garantir a estabilidade do sinal. Se o experimento não envolver imagens de lapso de tempo, certifique-se de que a fluorescência seja estável em duas ou três pilhas Z repetidas.
Adquira imagens com um intervalo Z de 0,5 micrômetros em uma profundidade total de pilha de seis micrômetros para levedura em brotamento. Se coletar pilhas Z, certifique-se de que o intervalo Z seja o mesmo para todas as imagens no conjunto de dados e inclua a célula inteira. Também adquira imagens de luz transmitidas para documentar os limites das células.
