Para começar, abra uma imagem de pilha Z multicanal em Fiji e abra o arquivo de script de análise de biossensor desejado. Clique em Executar na janela do editor de scripts para executar o script. Em seguida, insira as informações solicitadas na janela de diálogo exibida.
Selecione os números de canal do numerador e denominador para o cálculo da razão. Para as mitocôndrias alvo HyPer7, o numerador é o canal excitado a 488 nanômetros e o denominador é o canal excitado a 405 nanômetros. Selecione o número do canal da imagem de luz transmitida, se presente, ou zero, se não houver nenhum.
Em seguida, escolha o método de subtração de fundo desejado. Se o plano de fundo for uniforme, clique em selecionar uma área de imagem para medir o nível de plano de fundo na imagem. Depois, escolha o método de subtração de ruído desejado para reduzir a variação aleatória na leitura do detector.
Clique em Selecionar uma área de imagem. Selecione a opção de valor fixo para inserir um nível de ruído medido anteriormente, que geralmente funciona bem se as condições de imagem forem mantidas constantes. Para detecção precisa e consistente de mitocôndrias, selecione um algoritmo de limiar, como Otsu ou Entropia Máxima.
Use o mesmo algoritmo para todas as imagens em um experimento, mas certifique-se de que as mitocôndrias sejam reconhecidas com precisão. Em seguida, selecione o número de regiões de interesse por célula. Por exemplo, se medir as diferenças do botão mãe, selecione dois.
Selecione a pasta de saída onde as imagens de medidas e proporções serão salvas. Para correção de plano de fundo ou ruído, escolha Selecionar uma área de imagem. Siga as instruções para desenhar uma área de plano de fundo usando a ferramenta ROI de retângulo e clique em OK.
Ao analisar células individuais ou regiões subcelulares, desenhe regiões de interesse com base na imagem de campo brilhante. A ROI não precisa corresponder precisamente ao contorno celular, pois apenas as mitocôndrias limiares dentro da ROI serão medidas. Depois de criar cada ROI, pressione T para adicionar o ROI selecionado ao ROI Manager.
Marque Mostrar tudo no Gerenciador de ROI para documentar as células marcadas. Cada região adicionada aparecerá como um item numerado na lista Gerenciador de ROI. Se analisar mais de um ROI por célula, marque as ROIs na mesma ordem para cada célula analisada.
Depois que todos os ROIs desejados tiverem sido adicionados ao gerenciador de ROI, clique em OK na janela de diálogo Marcar células. Em seguida, selecione o formato da tabela de medição. Na janela de diálogo Multimedida, marque as opções de medida de todas as fatias e uma linha por fatia para produzir uma tabela com o formato desejado.
Use as tabelas de ROI múltiplo do processo. rscript para processar as tabelas criadas com a opção de uma linha por fatia. Não marque a opção append-results.
Salve os arquivos de saída na pasta selecionada usando o script. Agora abra a imagem de pilha de proporção Z em Fiji para gerar uma imagem de proporção colorida. Em seguida, abra o colorize_ratio_image.
ijm e clique em Executar na janela do editor de scripts. Uma janela de diálogo solicitando a inserção das informações solicitadas será exibida. Na opção não modulada, todos os pixels mitocondriais aparecem no mesmo brilho.
Algumas imagens podem parecer barulhentas, pois pixels fracos e brilhantes contribuem para a imagem de proporção. Use a opção de intensidade modulada para reduzir o ruído. No método dos valores mínimos e máximos exibidos, escolha valores próximos aos valores mínimos e máximos médios observados em um experimento.
Para garantir a consistência, adquira todas as imagens usando as mesmas condições de imagem e exiba todas as imagens usando os mesmos valores mínimo e máximo. Em seguida, selecione o modo de projeção para projetar a pilha Z e mostrar toda a população mitocondrial antes da colorização. Para uma projeção de intensidade máxima, selecione a máxima.
Para criar uma projeção de intensidade média, selecione média. Por fim, selecione a pasta para salvar as imagens coloridas. Se a opção não modulada estiver selecionada, escolha um esquema de cores na janela de diálogo exibida.
Utilize as tabelas de pesquisa RGB de fogo ou arco-íris embutidas em Fiji ou qualquer tabela de pesquisa desejada no formato LUT do ImageJ. Use o script para salvar os arquivos de saída na pasta selecionada. A razão reduzida oxidada das mitocôndrias marcadas HyPer7 mostrou uma resposta dose-dependente à concentração de peróxido de hidrogênio, que atingiu um platô em um a dois milimolares adicionados externamente de peróxido de hidrogênio.
Diferenças no peróxido de hidrogênio mitocondrial foram observadas dentro das células de levedura. Uma diminuição estatisticamente significativa na leitura do biossensor de peróxido de hidrogênio foi detectada nas mitocôndrias do broto em comparação com a célula-mãe.
