No dia zero placa 10 milhões de células 293T em 30 mililitros de DMEM livre de antibiótico contendo 10% FBS em uma placa de 15 centímetros. Prepare um total de 10 desses pratos. No dia seguinte, que é o primeiro dia, confirme que as células estão 80% confluentes e prontas para transfecção.
Em seguida, em um tubo cônico de 50 mililitros sequencialmente, adicione 600 microlitros de 0,5 microgramas por mistura de plasmídios de embalagem de microlitros e biblioteca de código de barras de plasmídios de 60 microlitros. Em um tubo cônico separado de 15 mililitros, misture 900 microlitros de reagente de transfecção e 12 mililitros de DMEM por vórtice. Adicione 12,9 mililitros desta mistura à mistura de ADN e mexa para combinar.
Sem misturar mais, incube a mistura à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, adicione 2,5 mililitros da mistura incubada a cada prato de 15 centímetros contendo as células 293T e incube as células durante a noite em uma incubadora de cultura de tecidos. No terceiro dia, colha o vírus passando o meio através de uma unidade de filtragem de 0,2 mícron.
Alíquota o filtrado contendo partículas virais em tubos cônicos de 15 mililitros. Além disso, prepare cinco alíquotas de um mililitro de vírus filtrado em frascos de crio para titulação viral. Para titular os pools lentivirais, adicione 65 microlitros de polímero catiônico a um frasco de vidro estéril contendo 65 mililitros de meios de crescimento de células tumorais.
Pipetar um mililitro do polímero contendo o meio por poço em 11 placas de cultura de tecidos de seis poços. Em seguida, tripsinize as células tumorais de passagem precoce. Depois de contar as células usando um método preferido, transfira as células para as placas de seis poços.
Descongele as alíquotas de um mililitro do lentivírus de 48 horas do congelador em banho-maria a 37 graus Celsius. Siga a tabela para preparar a infecção para cada módulo viral.
