Para a infecção lentiviral, plaquear as células-alvo do MPNST tripsinizado após contá-las, mantendo 2,5 milhões de células por placa de 15 centímetros. Transduzir as células com o vírus descongelado a uma multiplicidade de 0,5 de infecção, na presença de cinco microgramas por mililitro do polímero catiônico. Tripsinizar as células três dias após a adição de puromicina.
Centrifugar metade da população celular a 200 G por cinco minutos em uma centrífuga de mesa. Depois de re-plaquear a outra metade da população celular, cultivá-los por aproximadamente sete duplicações populacionais antes da colheita e centrifugação, como demonstrado anteriormente. Divida o pellet de célula ressuspensa correspondente ao tempo desejado em dois tubos de polimetilpenteno de 15 mililitros.
Adicione 500 microlitros de 10% SDS por tubo. Misture e incube à temperatura ambiente durante cinco minutos. Coloque os tubos em um dispositivo de cisalhamento de DNA para sonicar o DNA.
Após a adição de fenol e clorofórmio. Misture bem agitando vigorosamente na velocidade máxima possível por 45 a 60 segundos. Transfira três mililitros da fase superior clara resultante de cada tubo para outro tubo fresco de 15 mililitros.
Adicione 0,5 mililitros de acetato de sódio três molares e quatro mililitros de isopropanol e misture bem. Depois de centrifugar os tubos por 30 minutos a 7, 200 G e 20 graus Celsius e descartar o sobrenadante, adicione 0,5 mililitros de etanol 70% ao pellet e desaloje-o pipetando para cima e para baixo. Combine os pellets ressuspensos de ambos os tubos em um tubo centrífugo de 1,5 mililitro.
Realize as reações de PCR usando as condições mostradas na tela. Após a segunda reação de PCR, combinar as quatro amostras em um tubo de microcentrífuga. E adicione 80 microlitros de corante de carregamento 6X a ele.
Visualize o gel e confirme uma banda em aproximadamente 250 pares de bases. Células MPNST humanas transduzidas com um controle não-alvo e lentivírus, expressando quatro diferentes RNA hairpin curto Bcl-6, revelaram que vários dos RNAs hairpin curtos Bcl-6 reduziram acentuadamente o número de células. O immuno blot mostrou que o grau de diminuição no número de células correlacionou-se com o grau de knockdown de Bcl-6.
