Comece removendo o meio estágio II da suspensão de células iPSC no sétimo dia de cultura. Agora lave as células com dois mililitros de DPBS. Pipetar um mililitro de solução de desprendimento celular para cada poço.
Em seguida, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus por cinco minutos. Após a incubação, adicione um mililitro de meio estágio II às células e misture completamente até que as células se desprendam da superfície. Recolher a suspensão celular num tubo de 15 mililitros e, em seguida, centrifugar-a a 400g durante três minutos à temperatura ambiente.
Após a centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em dois mililitros de meio estágio III. Misture a solução delicadamente. Agora, semeie a suspensão em uma placa de seis poços e baixa aderência na proporção de um para três.
Coloque a placa em um agitador orbital em uma incubadora regulada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Para remover o meio na cultura de suspensão, primeiro corte a ponta de uma pipeta de um mililitro usando tesoura asséptica. Em seguida, agite suavemente a placa de seis poços para centralizar os organoides.
Em seguida, aspirar os organoides com as pipetas preparadas e colocá-los em um tubo de 15 mililitros, deixando-os repousar por cinco minutos. Aspirar o sobrenadante, garantindo que os organoides permaneçam na base do tubo. Em seguida, pipetar o meio estágio III na placa.
Pipetar a mistura para ressuspender os organoides. Replaquear os organoides de volta em uma placa de seis poços e baixa adesão. Continue agitando a placa de baixa adesão a 60 rotações por minuto na incubadora.
No 12º dia, substituir o meio pelo meio estágio IV. Os organoides renais apresentam estruturas tubulares e são facilmente observados em imagens de campo claro após 18 dias de agregação. Células endoteliais CD31 foram induzidas.
Dextran foi levado para os túbulos proximais dos organoides renais.
