Para começar, coloque o dispositivo micro sim montado em abraçadeiras de mangueira estéreis. Cultivar o dispositivo em uma grande placa de Petri estéril. Para umidade extra, coloque uma tampa de tubo cônico de 50 mililitros cheia de água estéril.
Para preparar o dispositivo para cultivo celular, enxágue a câmara superior com 100 microlitros de água. Em seguida, prepare uma solução de revestimento misturando colágeno quatro, fibronectina bovina e água estéril. Retire a água da câmara superior e adicione 100 microlitros de solução de revestimento.
Incubar a câmara a 37 graus Celsius por duas a quatro horas. Após a incubação, substituir a solução de revestimento na câmara superior por 100 microlitros de HECSR à temperatura ambiente. Adicionar 20 microlitros de solução HECSR na câmara inferior.
Para passar, EECM-BMEC como células, adicione uma mistura de enzimas de desprendimento celular às células e incube a 37 graus Celsius por cinco a oito minutos. Em seguida, pipetar a suspensão celular e adicioná-la a quatro vezes o volume do meio endotelial em um tubo centrífugo. Centrifugar a 200G por cinco minutos e ressuspender as células em um mililitro de HECSR.
Semeando as células a uma densidade de 40.000 células por centímetro quadrado na câmara superior e incubar a 37 graus Celsius por duas a quatro horas para facilitar a adesão celular. Após a incubação, trocar o meio por HECSR fresco em ambas as câmaras. Fixe as células adicionando 20 microlitros de metanol a 100%, resfriados a menos 20 graus Celsius na câmara inferior e 50 microlitros na câmara superior.
Incubar o dispositivo à temperatura ambiente durante dois a 10 minutos. Em seguida, lave as células adicionando 20 microlitros de PBS na câmara inferior e 100 microlitros na câmara superior. Após cada lavagem, confirme a ausência de bolhas na câmara inferior.
Bloqueie as células por 30 minutos adicionando 20 microlitros da solução de bloqueio na câmara inferior e 50 microlitros na câmara superior. Após o bloqueio, substituir o volume na câmara superior por 50 microlitros da solução de anticorpos primários e incubar por uma hora à temperatura ambiente. Após a lavagem com PBS, adicionar 50 microlitros da solução de anticorpos secundários na câmara superior e incubar por uma hora protegido da luz.
Após a lavagem com PBS, adicione 50 microlitros de Hoechst à câmara superior e incube durante três minutos. Em seguida, adicione 20 microlitros de PBS à câmara inferior e 100 microlitros à câmara superior. Fotografe o dispositivo imediatamente em um microscópio confocal.
Localize a janela da membrana usando uma objetiva de 40x de longa distância de trabalho úmida e mude para canais de fluorescência para verificar a coloração Hoechst e junção. Densidades ideais de assentos para cultura de células HIPSC e BPLC de subsementes são demonstradas aqui. A co-cultura derivada do HIPSC foi mais fácil de distinguir em imagens de contraste de fase do que as co-culturas primárias.
A semeadura baixa da BPLC resulta em baixa cobertura parasitária e aglomeração, enquanto comer em excesso leva à camada do parasita descascando da membrana. Na co-cultura de células derivadas do HIPSC imunomarcadas, duas camadas de células foram vistas em estreita proximidade, separadas apenas por uma fina nanomembrana de nitreto de silício. No ensaio de permeabilidade, a alta variabilidade na permeabilidade das células endoteliais cultivadas por dois dias indica que dois dias de cultura foram insuficientes para a maturação da barreira.
Além disso, não houve diferenças significativas na permeabilidade entre os laboratórios após a maturação da barreira a partir de quatro dias.
