Para começar, após adquirir o longo RNA não codificante de interesse, incubar o tampão de hibridização a 37 graus Celsius por duas horas. Em seguida, dissolver as quatro sondas de densidade óptica em 160 microlitros de água deionizada tratada com pirocarbonato de dietila longe da luz. Prepare 200 microlitros da mistura de sonda para cada poço e configure uma série de 50, 25, 12,5 e seis microgramas por mililitro.
Desnature a mistura da sonda a 73 graus Celsius por cinco minutos. Pegue uma placa de cultura de células de 12 poços contendo células 143B em folhas de vidro estéreis. Retire o meio e lave duas vezes por cinco minutos com PBS.
Coloque as células em um agitador. Em seguida, retire o PBS e adicione 200 microlitros de etanol 100% a cada poço, fixando por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova o etanol, adicione 200 microlitros de Triton X-100 a 0,1% em cada poço e incube por 15 minutos à temperatura ambiente.
Remover Triton X-100 a 0,1% e lavar duas vezes durante cinco minutos com PBS. Em seguida, remova o PBS, adicione 200 microlitros de duas vezes citrato de sódio salino ou tampão SSC em cada poço e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Retire duas vezes o tampão SSC, adicione 200 microlitros de etanol a 70% em cada poço e incube por três minutos à temperatura ambiente.
Descarte o etanol 70%, adicione 200 microlitros de etanol 85% em cada poço e incube por três minutos à temperatura ambiente. Em seguida, descarte o etanol 85%, adicione 200 microlitros de etanol 100% a cada poço e incube por três minutos à temperatura ambiente. Depois, absorva e descarte o etanol 100% e deixe os poços secarem.
Em seguida, adicione 200 microlitros de mistura de sonda desnaturada a cada poço e, em seguida, incube a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, retire as amostras de 37 graus Celsius, descarte a mistura de sonda e adicione 200 microlitros de tampão pré-aquecido 0,4 vezes SSC 0,3%Tween 20 a cada poço e lave por dois minutos à temperatura ambiente. Remova o buffer 0,4 vezes SSC 0,3%Tween 20.
Adicionar 200 microlitros de duas vezes o tampão SSC 0,1%Tween 20 a cada poço e lavar por dois minutos à temperatura ambiente. Em seguida, descarte o buffer SSC 0,1%Tween 20 duas vezes. Adicione 200 microlitros de solução corante DAPI e core por 20 minutos no escuro em uma coqueteleira.
Após a coloração, descartar a solução de DAPI e lavá-la com PBS por dois minutos em temperatura ambiente. Por fim, adicione 50 microlitros de meio de montagem contendo goma à lâmina e coloque a tampa de vidro para fixar a corrediça. Imagens representativas de FISH SNHG6 em células de osteossarcoma humano são mostradas.
A sonda SNHG6 marcada com Cy3, que emite fluorescência vermelha, mostrou que SNHG6 está localizada principalmente no citoplasma. A cor de fundo foi observada quando se utilizou alta concentração de sonda.
