Este trabalho é apoiado por subsídios de (1) o Programa Nacional de P&D da China (2020YFE0201600); (2) a National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408); (3) Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation; (4) Projetos de Pesquisa dentro do Orçamento da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai (2021LK047).

Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes de todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo. A Figura 1 mostra o protocolo geral para RNA FISH; A Tabela 1 contém a composição de todas as soluções e a Tabela 2 contém as sequências de primers utilizadas neste protocolo.
1. Preparação da sonda
<ol><li>Identificar e adquirir a sequência FASTA de um lncRNA alvo de interesse, por exemplo, do GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Seguindo as indicações no site, projete as sondas ISH online19 e revise as sugestões do algoritmo de design para listar as sondas a serem encomendadas com o rótulo Cy3.</li>
	<li>Incubar o tampão de hibridização a 37 °C durante 2 h de antecedência.</li>
	<li>Dissolver 4 sondas de densidade óptica (OD) em 160 μL de ddH2O tratado com dietilpirocarbonato (DEPC) na concentração de 1 mg/mL longe da luz. NOTA: A densidade óptica (DO) representa a unidade de medida do DNA e do RNA. Geralmente, 1 unidade OD = 33 μg/mL de DNA.</li>
	<li>Preparar 200 μL da mistura de sonda para cada poço (1,2 μL-10 μL de sonda, 70 μL de tampão de hibridização, completar o volume com ddH2O a 200 μL tratados com DEPC) e montar uma série de 50 μg/mL, 25 μg/mL, 12,5 μg/mL e 6 μg/mL. NOTA: A concentração da sonda precisa ser explorada experimentalmente com antecedência. Uma alta concentração de sonda levará à ligação não específica de lncRNAs, enquanto uma baixa concentração de sonda levará à detecção insensível ou falha de lncRNAs.</li>
	<li>Desnaturar a mistura da sonda a 73 °C durante 5 min. NOTA: Se a sonda de DNA marcada com Cy3 for de fita dupla, desnature a sonda para DNA de fita simples a 95 °C por 5 minutos e, em seguida, resfrie rapidamente por 2 minutos no gelo.</li>
</ol>2. Preparação celular
<ol><li>Semear 50.000 células 143B por poço em lamínulas de vidro estéril em uma placa de cultura celular de 12 poços e incubá-las por 24 h (37 °C, 5% CO2) em DMEM. NOTA: O número específico de células semeadas aqui varia com o tamanho da célula, o que é apropriado para que as células semeadas atinjam uma confluência de 50% após serem incubadas por 24 h. As tampas de vidro estéreis são redondas para serem adequadas para a placa de 12 poços.</li>
	<li>Retire o meio e lave por 2 x 5 min com 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). NOTA: Preparar 1x PBS com ddH2O. O PBS sem tratamento com DEPC não pode ser usado porque contém RNase. Execute todas as etapas a seguir em condições livres de RNase.</li>
	<li>Remover 1x PBS e adicionar 200 μL de etanol 100% em cada poço para fixar por 15 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire o etanol, adicione 200 μL de Triton X-100 a 0,1% (em 1x PBS) em cada poço e incube por 15 min à temperatura ambiente. NOTA: O tempo precisa ser rigorosamente controlado com permeabilização Triton X-100 e não pode ser muito longo.</li>
	<li>Retire Triton X-100 a 0,1% e lave 2 x 5 min com 1x PBS. NOTA: Se o protocolo tiver que ser pausado aqui, substitua o PBS por etanol 70% (diluição de etanol 100% com ddH2O livre de RNase) e armazene a amostra a 4 °C por até 3 meses.</li>
	<li>Remover 1x PBS, adicionar 200 μL de 2x tampão citrato salino de sódio (SSC) (diluição de 20x SSC com ddH2O livre de RNase) em cada poço e incubar por 30 min a 37 °C.</li>
	<li>Remover 2x tampão SSC, adicionar 200 μL de etanol 70% em cada poço e incubar por 3 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Descarte o etanol 70%, adicione 200 μL de etanol 85% (diluição de etanol 100% com ddH2O livre de RNase) em cada poço e incube por 3 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Descarte o etanol 85%, adicione 200 μL de etanol 100% em cada poço e incube por 3 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Absorver e descartar etanol 100%; deixe os poços secarem.</li>
</ol>3. Hibridação in situ fluorescente (FISH)
<ol><li>Adicionar 200 μL de mistura de sonda (desnaturada como no passo 1.5) a cada poço e incubar a 37 °C durante a noite (16-18 h). NOTA: Existe uma forte correlação positiva entre a temperatura de hibridização e a concentração de sonda; Portanto, para otimizar o fundo, tanto a temperatura de hibridização quanto a concentração de sonda devem ser reduzidas.</li>
	<li>No dia seguinte, retire amostras a 37 °C e elimine a mistura de sonda. Adicionar 200 μL de tampão 0,4x SSC/0,3% Tween-20 a cada poço (pré-aquecido a 65 °C) e lavar por 2 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova o tampão 0,4x SSC/0,3% Tween-20, adicione 200 μL de 2x SSC/0,1% Tween-20 buffer a cada poço e lave por 2 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remover 2x tampão SSC/Tween-20 a 0,1%, adicionar 200 μL de solução corante com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1 μg/mL) e corar por 20 min longe da luz.</li>
	<li>Eliminar a solução corante DAPI e lavar com 1x PBS durante 2 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione 50 μL de meio de montagem contendo goma na lâmina e coloque a tampa de vidro na corrediça para fixar. NOTA: Certifique-se de colocar a tampa no slide com o lado da célula para baixo.</li>
	<li>Observe sob um microscópio de fluorescência. NOTA: Use um microscópio de fluorescência ou um microscópio confocal a laser; este último produz uma imagem de maior sensibilidade e clareza.</li>
</ol>

FISH para localização de RNA não codificante longo em células de osteossarcoma humano

<ol>
	<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+transcription+in+human+cells.">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li><li>Li, C. H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+role+of+long+noncoding+RNA+in+cancer+development+and+progression.">Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).</li><li>Pan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+FBXL19-AS1+regulates+osteosarcoma+cell+proliferation,+migration+and+invasion+by+sponging+miR-346.">lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).</li><li>Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+C2dat1+promotes+cell+proliferation,+migration,+and+invasion+by+targeting+miR-34a-5p+in+osteosarcoma+cells.">lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells.</a> Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).</li><li>Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+MATN1-AS1+for+prediction+of+prognosis+in+osteosarcoma+patients+and+its+cellular+function.">LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function.</a> Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).</li><li>Luo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+long+noncoding+RNA+biology+in+cancer.">Methods to study long noncoding RNA biology in cancer.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).</li><li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+TUSC7+inhibits+osteosarcoma+progression+through+the+miR-181a/RASSF6+axis.">lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis.</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).</li><li>Tong, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+RUSC1-AS1+promotes+osteosarcoma+progression+through+regulating+the+miR-340-5p+and+PI3K/AKT+pathway.">LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway.</a> Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ceRNA+in+cancer:+possible+functions+and+clinical+implications.">ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications.</a> Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).</li><li>Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+in+cultured+mammalian+cells.">RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes.">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li><li>Hazra, R., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+RNA+transcripts+and+proteins+in+whole-mount+mouse+preimplantation+embryos+using+single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunofluorescence+microscopy.">Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).</li><li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRNA+SNHG6+regulates+EZH2+expression+by+sponging+miR-26a/b+and+miR-214+in+colorectal+cancer.">lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 12 (1), 3 (2019).</li><li>Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LncRNA+SNHG6+is+associated+with+poor+prognosis+of+gastric+cancer+and+promotes+cell+proliferation+and+EMT+through+epigenetically+silencing+p27+and+sponging+miR-101-3p.">LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p.</a> Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).</li><li>Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+SNHG6+induced+cell+autophagy+by+targeting+miR-26a-5p/ULK1+signaling+pathway+in+human+osteosarcoma.">Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma.</a> Cancer Cell International. 19, 82 (2019).</li><li>Birgani, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+non-coding+RNA+SNHG6+as+a+potential+biomarker+for+hepatocellular+carcinoma.">Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma.</a> Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).</li><li>Nielsen, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+lncRNA+by+LNA-based+in+situ+hybridization+in+paraffin-embedded+cancer+cell+spheroids.">Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids.</a> Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+noncoding+RNA+SNHG6+regulates+p21+expression+via+activation+of+the+JNK+pathway+and+regulation+of+EZH2+in+gastric+cancer+cells.">Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells.</a> Life Sciences. 208, 295-304 (2018).</li><li>Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+techniques+for+paraffin-embedded+adult+coral+samples.">In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).</li><li>Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+RNA+FISH+(smFISH)+in+whole-mount+mouse+embryonic+organs.">Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).</li></ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo de RNA FISH pode não apenas detectar a localização de lncRNAs em células, mas também detectar a colocalização de outros RNAs, DNA ou proteínas nas células, que também podem ser usados para detectar a localização de lncRNAs em tecidos embebidos em parafina. Entretanto, o protocolo específico nesses casos é diferente, pois os tecidos emblocados em parafina necessitam ser desparafinados21. Este procedimento experimental pode ser aplicado em placas de 48 ou 96 poços, mas ...

Nossa compreensão do genoma humano tem sido grandemente expandida pelos recentes avanços na tecnologia do genoma completo. Cerca de 93% do genoma humano pode ser transcrito em RNAs, mas apenas 2% dos RNAs podem ser traduzidos em proteínas; os 98% restantes dos RNAs que não têm função de tradução de proteínas são chamados de RNA não codificantes (ncRNA)1. Como uma classe de RNAs não codificantes (ncRNAs), os ncRNAs longos (lncRNAs), contendo mais de 200 nucleotídeos2, têm atraído atenção crescente devido ao seu envolvimento em muitos processos fisiológicos e patológicos das células, como diferenciação, controle do ciclo, apoptose, migração e invasão 3,4,5 . Os LncRNAs desempenham seu papel através de vários mecanismos, tais como regulação da estrutura da cromatina e expressão gênica nuclear, controle do processo de splicing de RNAm e modificação pós-transcricional6. Os LncRNAs regulam a ocorrência, o desenvolvimento e a metástase de malignidades em ambos os níveis transcricional e pós-transcricional. A regulação transcricional é realizada no núcleo por afetar a transcrição do RNA via ligação às estruturas cromossômicas, enquanto a regulação pós-transcricional é realizada no citoplasma pelo controle dos genes-alvo via mecanismo endógeno competitivo de RNA (ceRNA)5,7,8. O CeRNA revelou um novo mecanismo de interação de RNA, a saber, que os lncRNAs podem atuar como uma esponja para adsorver miRNAs e inibir a degradação mediada por miRNA de genes-alvorelacionados9. Portanto, as informações sobre a localização subcelular dos lncRNAs, se um lncRNA específico está localizado no citoplasma ou no núcleo, são importantes para ajudar a identificar suas funções biológicas.
Atualmente, a localização do lncRNA é detectada principalmente por dois métodos, um é por ensaio de isolamento da fração núcleo/citoplasma e o outro é por RNA FISH. No primeiro, os RNAs nas frações citoplasmática e nuclear são extraídos respectivamente e, em seguida, a amplificação por PCR é realizada com primers específicos de lncRNA para detectar a proporção de lncRNAs no citoplasma e núcleo. A vantagem deste método é a eficiência do tempo, enquanto a desvantagem é que a localização real do lncRNA não é diretamente refletida pela proporção relativa de lncRNAs no citoplasma e núcleo. RNA FISH pode detectar a localização de lncRNA em células através do planejamento de sequências de cadeia antisense específicas para lncRNA seguidas de marcação com corantes fluorescentes10. Os métodos de RNA FISH foram aprimorados com os avanços nas técnicas de sonda e métodos de detecção, incluindo conjuntos de múltiplas sondas oligo marcadas com fluoróforos11, sondas LNA 12 e sondas de DNA ramificado (bDNA)13. RNA FISH pode não apenas detectar a localização de lncRNA, mas também detectar a colocalização de outros RNAs, DNA ou proteínas usando imunofluorescência de dupla cor ou multicolorida14.
Neste trabalho, incluímos como exemplo o protocolo detalhado de detecção de localização intracelular do gene 6 do RNA nucleolar pequeno RNA do lncRNA (SNHG6) em células de osteossarcoma (143B) por RNA FISH. SNHG6 é um lncRNA de nucleotídeo 600-730 em sua forma spliced madura e identificado como um novo oncogene em diversos cânceres humanos, incluindo câncer colorretal, câncer gástrico, carcinoma de células claras do ovário, osteossarcoma e carcinoma hepatocelular15,16,17,18. Estudos têm confirmado o envolvimento do SNHG6 em comportamentos biológicos de células cancerosas, como proliferação, EMT e autofagia, e demonstrado a localização citoplasmática do SNHG6 onde ele pode afetar os genes alvo por ligação (esponja) aos miRNAs15,16,17. Este protocolo detalhado de detecção da localização intracelular do SNHG6 por RNA FISH é apresentado neste artigo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic cell counter</td>
			<td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td>
			<td>IC1000</td>
			<td>Counting cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate-12</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>3513,corning</td>
			<td>Place the coverslips in the plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Cell line (143B)</td>
			<td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>CRL-8303</td>
			<td>osteosarcoma cancer cell line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>&#160;430790, Corning</td>
			<td>Centrifuge the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>abs7026</td>
			<td>The cells are seeded on the coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 label-SNHG6 DNA probe</td>
			<td>Shanghai GenePharma Co.,Ltd</td>
			<td>A10005</td>
			<td>Detect SNHG6 location</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>LM-E1141</td>
			<td>Cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Bath Incubator</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>DKT200-2&#160;</td>
			<td>Incubation at different high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 100%&#160;</td>
			<td>Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd</td>
			<td>10009218</td>
			<td>dehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD</td>
			<td>Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus</td>
			<td>Observation and positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD</td>
			<td>DHP-9051</td>
			<td>The samples were incubated at 37 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>E675004</td>
			<td>Attach the coverslips to the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.</td>
			<td>TS-8S</td>
			<td>Washing sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>188105</td>
			<td>The coverslips is placed on the slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600198</td>
			<td>Permeable membrane and nuclear membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Trypsin (0.25%)</td>
			<td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>25200056, Gibco</td>
			<td>trypsin treatment of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>A600560</td>
			<td>detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna fluorescence in situ hybridization for long non-coding rna localization in human osteosarcoma cells

Os papéis importantes dos RNAs longos não-codificadores (lncRNAs) no câncer têm sido estudados, tais como a regulação da proliferação, transição epitélio-mesenquimal (EMT), migração, infiltração e autofagia de células cancerosas. A detecção de localização de lncRNAs em células pode fornecer informações sobre suas funções. Ao projetar a sequência de cadeia antisense específica para lncRNA seguida de marcação com corantes fluorescentes, a hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) pode ser aplicada para detectar a localização celular de lncRNAs. Juntamente com o desenvolvimento da microscopia, as técnicas de RNA FISH agora permitem até mesmo a visualização dos lncRNAs mal expressos. Este método pode não só detectar a localização de lncRNAs sozinho, mas também detectar a colocalização de outros RNAs, DNA, ou proteínas usando imunofluorescência de cor dupla ou multicolorida. Aqui, incluímos o procedimento detalhado de operação experimental e precauções de RNA FISH usando lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) em células humanas de osteossarcoma (143B) como um exemplo, para fornecer uma referência para pesquisadores que desejam realizar experimentos de RNA FISH, especialmente lncRNA FISH.

Our understanding of the human genome has been greatly expanded by recent advances in whole-genome technology. About 93% of the human genome can be transcribed into RNAs, but only 2% of the RNAs can be translated into proteins; the remaining 98% of RNAs that have no protein translation function are called non-coding RNA (ncRNA)1. As a class of noncoding RNAs (ncRNAs), long ncRNAs (lncRNAs), containing over 200 nucleotides2, have attracted increasing attention due to their involvement in many physiological and pathological processes of the cells, such as differentiation, cycle control, apoptosis, migration, and invasion3,4,5. LncRNAs play their roles through various mechanisms, such as regulating chromatin structure and nuclear gene expression, controlling the mRNA splicing process, and posttranscriptional modification6. LncRNAs regulate the occurrence, development, and metastasis of malignancies at both the transcriptional and posttranscriptional levels. Transcriptional regulation is realized in the nucleus by affecting RNA transcription via binding to the chromosomal structures, while posttranscriptional regulation is realized in the cytoplasm by controlling the target genes via an endogenous competitive RNA (ceRNA) mechanism5, 7, 8. CeRNA has revealed a new mechanism of RNA interaction, namely that lncRNAs can act as a sponge to adsorb miRNAs and inhibit the miRNA-mediated degradation of related target genes9. Therefore, the information regarding the subcellular localization of lncRNAs, whether a specific lncRNA is located in the cytoplasm or nucleus, is important to help identify their biological functions.
At present, lncRNA localization is mainly detected by two methods, one is by nucleus/cytoplasm fraction isolation assay, and the other is by RNA FISH. In the former, RNAs in the cytoplasmic and the nuclear fractions are extracted respectively, and then PCR amplification is performed with specific lncRNA primers to detect the ratio of lncRNAs in the cytoplasm and nucleus. The advantage of this method is time efficiency, while the disadvantage is that the actual lncRNA localization is not directly reflected by the relative proportion of lncRNAs in the cytoplasm and nucleus. RNA FISH can detect lncRNA localization in cells through the design of lncRNA-specific antisense chain sequences followed by labeling with fluorescent dyes10. The RNA FISH methods have been improved with advances in probe techniques and detection methods, including fluorophore-labeled multiple oligo probe sets11, LNA probes12, and branched-DNA (bDNA) probes13. RNA FISH can not only detect the localization of lncRNA, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence14.
In this work, we have included the detailed intracellular localization detection protocol of lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in osteosarcoma cells (143B) by RNA FISH as an example. SNHG6 is a 600-730 nucleotide lncRNA in its mature spliced form and identified as a novel oncogene in diverse human cancers, including colorectal cancer, gastric cancer, ovarian clear cell carcinoma, osteosarcoma, and hepatocellular carcinoma15,16,17,18. Studies have confirmed the involvement of SNHG6 in biological behaviors of cancer cells, such as proliferation, EMT, and autophagy, and shown the cytoplasmic localization of SNHG6 where it may affect the target genes by binding (sponging) the miRNAs15,16,17. This detailed detection protocol of SNHG6 intracellular localization by RNA FISH is presented herein.

Autor em destaque: RNA FISH para localizar lncRNA-SNHG6 em células de osteossarcoma 

Hibridização in situ por fluorescência de RNA para localização de RNA longo e não codificante em células de osteossarcoma humano

The scope of our research is to provide a detailed RNA FISH protocol that's providing a reference for scientists who want to perform RNA FISH experiments. Our research has established that RNA FISH can be used to localize lncRNA in human osteosarcoma cells. Our protocol provided a comprehensive experimental procedure and the precautions for RNA FISH using lncRNA-SNHG6 in human osteosarcoma cells as a reference.

Imagens representativas de FISH SNHG6 em células humanas de osteossarcoma são mostradas (Figura 2). O controle negativo é tratado com a sonda Ctrl negativa; o controle positivo é tratado com sonda U6 20. A sonda SNHG6 e a sonda U6 são marcadas com Cy3, que emite fluorescência vermelha. DAPI é um corante que cora o DNA, que emite fluorescência azul. Esse resultado mostra que o SNHG6 está localizado principalmente no citoplasma, e essa informação pode fornece...

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O presente protocolo descreve um método de hibridização in situ por fluorescência de RNA para localizar os lncRNAs em células humanas de osteossarcoma.

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...

O escopo de nossa pesquisa é fornecer um protocolo detalhado de RNA FISH que está fornecendo uma referência para os cientistas que desejam realizar experimentos de RNA FISH. Nossa pesquisa estabeleceu que o RNA FISH pode ser usado para localizar lncRNA em células de osteossarcoma humano. Nosso protocolo forneceu um procedimento experimental abrangente e as precauções para RNA FISH usando lncRNA-SNHG6 em células humanas de osteossarcoma como referência.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

1.0K visualizações.  Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. O escopo de nossa pesquisa é fornecer um protocolo detalhado de RNA FISH que está fornecendo uma referência para os cientistas que desejam realizar experimentos de RNA FISH. Nossa pesquisa estabeleceu que o RNA FISH pode ser usado para localizar lncRNA em células de osteossarcoma humano. Nosso protocolo forneceu um procedimento experimental abrangente e as precauções para RNA FISH usando lncRNA-SNHG6 em células humanas de osteossarcoma como referência.

Vídeo: Autor em destaque: RNA FISH para localizar lncRNA-SNHG6 em células de osteossarcoma 

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition (EMT), migration, infiltration, and autophagy of cancer cells. Localization detection of lncRNAs in cells can provide insight into their functions. By designing the lncRNA-specific antisense chain sequence followed by labeling with fluorescent dyes, RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be applied to detect the cellular localization of lncRNAs. Together with the development of microscopy, the RNA FISH techniques now even allow for visualization of the poorly expressed lncRNAs. This method can not only detect the localization of lncRNAs alone, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence. Here, we have included the detailed experimental operation procedure and precautions of RNA FISH by using lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in human osteosarcoma cells (143B) as an example, to provide a reference for researchers who want to perform RNA FISH experiments, especially lncRNA FISH.

The present protocol describes a method of RNA fluorescence in situ hybridization to localize the lncRNAs in human osteosarcoma cells.

Pesquisa do câncer

RNA Fluorescence In Situ Hybridization to Localize the lncRNAs in Human Osteosarcoma Cells

To begin, after acquiring the long non-coding RNA of interest, incubate the hybridization buffer at 37 degrees Celsius for two hours. Next, dissolve the four optical density probe in 160 microliters of diethyl pyrocarbonate treated deionized water away from the light. Prepare 200 microliters of the probe mixture for each well, and set up a series of 50, 25, 12.5, and six micrograms per milliliter.Denature the probe mix at 73 degrees Celsius for five minutes. Take a 12-well cell culture plate containing 143B cells on sterile glass cover slips. Remove the medium and wash twice for five minutes with PBS.Place the cells on a shaker. Then remove the PBS and add 200 microliters of 100%ethanol to each well, fixing for 15 minutes at room temperature. Then remove the ethanol, add 200 microliters of 0.1%Triton X-100 to each well, and incubate for 15 minutes at room temperature.Remove 0.1%Triton X-100 and wash two times for five minutes with PBS. Next, remove PBS, add 200 microliters of two times sodium-saline citrate or SSC buffer into each well, and incubate for 30 minutes at 37 degrees Celsius. Remove two times SSC buffer, add 200 microliters of 70%ethanol into each well, and incubate for three minutes at room temperature.Discard the 70%ethanol, then add 200 microliters of 85%ethanol into each well and incubate for three minutes at room temperature. Next, discard the 85%ethanol, add 200 microliters of 100%ethanol to each well, and incubate for three minutes at room temperature. Afterward, absorb and discard the 100%ethanol and allow the wells to dry.Next, add 200 microliters of denatured probe mixture to each well, then incubate at 37 degrees Celsius overnight. The following day, remove samples from 37 degrees Celsius, discard the probe mixture, and add 200 microliters of preheated 0.4 times SSC 0.3%Tween 20 buffer to each well and wash for two minutes at room temperature. Remove the 0.4 times SSC 0.3%Tween 20 buffer.Add 200 microliters of two times SSC 0.1%Tween 20 buffer to each well and wash for two minutes at room temperature. Next, discard the two times SSC 0.1%Tween 20 buffer. Add 200 microliters of DAPI staining solution and stain for 20 minutes in the dark on a shaker.After staining, discard the DAPI solution and wash it with PBS for two minutes at room temperature. Lastly, add 50 microliters of mounting medium containing gum to the slide and place the glass cover slip to fix the slide. Representative SNHG6 FISH images in human osteosarcoma cells are shown.SNHG6 probe labeled with Cy3, which emits red fluorescence, showed that SNHG6 is mainly localized in the cytoplasm. A background color was observed when using a high concentration of probe.