Para começar, pegue as amostras fecais humanas preparadas. Resfrie a centrífuga refrigerada de alta velocidade a 4 graus Celsius. Use PBS para ajustar o peso dos tubos de amostra para 0,1 gramas e centrifuga-los a 3.000 G por 20 minutos a 4 graus Celsius.
Usando uma pipeta de plástico, transfira o sobrenadante em dois tubos de 50 mililitros, deixando 1 mililitro para trás. Em seguida, centrifugar o sobrenadante a 12.000 G por 30 minutos a 4 graus Celsius. Usando uma seringa de 20 mililitros, aspirar o sobrenadante e remover a agulha da seringa.
Filtre o líquido através de filtros de 0,22 micrômetros em tubos de 50 mililitros. Em seguida, limpe o balde com álcool 75% para eliminar qualquer contaminação restante. Transfira aproximadamente 30 mililitros do sobrenadante fecal filtrado para o tubo de ultracentrífuga.
Encha o tubo com aproximadamente 8 mililitros de PBS, deixando uma lacuna de 3 milímetros da abertura do tubo. Coloque os dois tubos de ultracentrífuga em caçambas de ultracentrifugação opostas e equalize o peso das duas caçambas usando PBS. Coloque todas as caçambas no rotor, independentemente de estarem carregadas com tubos.
Coloque as amostras na centrífuga, inicie o vácuo e gire-as a 160.000 G por 70 minutos a 4 graus Celsius. Assim que a centrifugação terminar, solte o vácuo da câmara e abra a porta da ultracentrífuga. Em seguida, remova imediatamente o rotor.
Transfira as caçambas do rotor para o rack e pegue os tubos usando um nipper. Descarte o sobrenadante e salve os pellets marrons visíveis. Adicione 1 mililitro de PBS pré-resfriado para ressuspender completamente os pellets.
Encha o tubo com aproximadamente 37 mililitros de PBS, deixando uma lacuna de 3 milímetros da abertura. Após realizar mais uma rodada de ultracentrifugação, descarte o sobrenadante e deixe o tubo invertido por 5 minutos. Remova qualquer solução restante na parede interna com limpadores.
Usando uma pipeta de 1.000 microlitros, adicione 1,2 mililitros de PBS pré-resfriado para ressuspender os pellets e misture-os por pipetagem. Transfira 1,2 mililitros da solução PBS BEV de um tubo de ultracentrífuga para um microtubo limpo de 1,5 mililitro.
