Para começar, tome 500 microlitros da solução preparada de PBS/BEV. Combine-o com três mililitros de PBS e misture suavemente usando uma pipeta de 1.000 microlitros. Coloque um tubo de ultracentrífuga de 31 mililitros em uma placa de espuma com furos e rotule o tubo com uma seta para baixo.
Em seguida, segure uma pipeta de 1.000 microlitros verticalmente e adicione três mililitros da solução de iodixanol a 50% no fundo do tubo. Coloque um suporte de tubo ligeiramente acima do nível da placa de espuma abaixo da abertura do tubo e incline o tubo para um ângulo de 70 graus. Usando uma pipeta de 1.000 microlitros, adicione três mililitros de solução de iodixanol a 40% sobre a solução de iodixanol a 50%.
Em seguida, coloque três mililitros de solução de iodixanol a 20% sobre a solução de iodixanol a 40%. Usando uma pipeta de 1.000 microlitros, adicione três mililitros de uma solução de iodixanol a 10% sobre a solução preparada de iodixanol a 20%. Em seguida, adicione 3,5 mililitros da solução de PBS/BEV sobre a solução de iodixanol a 10% e retorne suavemente os tubos para uma posição vertical.
Agora, posicione um tubo de ultracentrífuga de 31 mililitros em uma placa de espuma com furos e rotule-o com uma seta para cima. Usando uma pipeta de 1.000 microlitros, adicione verticalmente 2,5 mililitros da solução estoque de iodixanol a 60% no fundo do tubo e combine-a com 500 microlitros de solução PBS/BEV para obter três mililitros de solução de BEV de iodixanol a 50%. Misture bem a solução por pipetagem.
Em seguida, após a camada de 40, 20 e 10% de solução de iodixanol em sequência, use uma pipeta de 1.000 microlitros para adicionar 3,5 mililitros de PBS sobre a solução de iodixanol a 10%. Ajuste o peso dos dois tubos com PBS para um peso total dentro de mais menos 0,005 gramas. Em seguida, posicione os tubos nos baldes e centrifugue-os a 160.000 G por sete horas a quatro graus Celsius.
Usando um pipetter, colete as frações obtidas de um modo de ultracentrifugação gradiente sequencialmente de cima para baixo contra a parede lateral em 10 tubos de ultracentrífuga separados de 38,5 mililitros. Em seguida, ultracentrifugar as frações a 160.000 G por 70 minutos a quatro graus Celsius. Retire o sobrenadante e inverta os tubos ultracentrífugos por cinco minutos.
Em seguida, ressuspenda os pellets em 200 microlitros de PBS pré-resfriado usando uma pipeta de 200 microlitros. Transfira a solução PBS/BEV para um microtubo limpo de 1,5 mililitros. Rotular as frações de F1 a F10 como obtidas a partir de um modo de ultracentrifugação de gradiente e proceder à análise.
