Para começar, borrife o rato eutanasiado com álcool a 75%. Em seguida, você esterilizou a tesoura dissecante para abrir a pele e expor a cavidade torácica. Corte o diafragma, depois continue cortando para cima em direção à mandíbula inferior e remova cuidadosamente o excesso de tecido conjuntivo e gordura expondo a artéria carótida.
Em seguida, corte a veia cava inferior para fazer o sangue fluir para fora da circulação fechada. Usando uma seringa, injete lentamente 20 mililitros de solução de perfusão pré-refrigerada no ventrículo esquerdo. Coloque o rato sob um microscópio estereoscópico.
Em seguida, usando uma tesoura microdissecante, descasque a gordura e os tecidos conjuntivos ao redor da artéria carótida. Isole a artéria carótida e lave-a com PBS para eliminar qualquer sangue residual. Transfira a artéria para uma placa de seis poços contendo 1,5% de SFB no gelo.
Usando tesoura microdissecante, disseque a artéria carótida longitudinalmente e coloque-a plana em uma nova placa de seis poços contendo um mililitro de FBS sobre gelo. Lave cuidadosamente a íntima da artéria com FBS para remover o sangue residual. Corte a artéria em pedaços de tecido de dois milímetros quadrados e transfira-os para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.
Centrifugar a 400 G durante 5 minutos a 4 graus Celsius para afundar os tecidos para o fundo. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os tecidos em 500 microlitros de reagente de dissociação A.Coloque o tubo em banho-maria de 37 graus Celsius por uma hora pipetando suavemente com uma pipeta de um mililitro a cada 10 minutos. Em seguida, adicione 500 microlitros de 5% FBS no tubo e misture bem.
Filtre a suspensão celular através de um filtro de células estéril de 40 mícrons em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, centrifugar o filtrado e remover o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 200 microlitros de reagente de dissociação B.Coloque o tubo em banho-maria para dissociar totalmente as células em uma única suspensão celular. Após cinco minutos, adicionar 200 microlitros de FBS a 5% para encerrar a reação de digestão, centrifugar a suspensão e descartar o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 100 microlitros de PBS no gelo.
Observações microscópicas mostraram que a combinação do reagente de dissociação B com o reagente A levou a uma dissociação mais completa do tecido da artéria carótida em comparação com o uso isolado do reagente de dissociação A. Um total de 176.000 células únicas foi coletado de nove carótidas esquerdas, com a maioria dos vasos vasculares sendo dissociados com sucesso em células únicas com alta viabilidade. Após a digestão, o agrupamento não supervisionado baseado em SIRAH revelou quatro tipos celulares principais em artérias carótidas normais de camundongos.
