Para começar, mantenha a esterilidade limpando luvas, cartuchos e placas de cultura com etanol 70%. Em seguida, ligue o compressor da bioimpressora e selecione o botão inicializado para inicializar a impressora. Limpe as superfícies dentro da impressora com etanol 70%.
Usando o botão Executar impressão, carregue o arquivo de impressão e abra o PDF do Protocolo de Impressão. Descongelar biotinta, fluidos ativadores e 50 mililitros de meio completo à temperatura ambiente. Prepare o cartucho de impressão conforme as instruções no PDF do Protocolo de Impressão, garantindo os volumes corretos de reagentes em compartimentos especificados.
Em seguida, adicione 1,2 mililitros de F3 a C1, 1,2 mililitros de F32 a C2 e 200 microlitros de F261 a C4. Retire a placa revestida de polietilenimina e laminina da incubadora. Ajuste o compartimento do suporte da placa para uma placa de perfil baixo. Insira a placa no compartimento direito do suporte da placa da impressora.
Retire a tampa da placa e coloque-a no suporte da tampa. Coloque o cartucho de impressão na bioimpressora e selecione o botão Base inerte de impressão para iniciar a impressão. Após o descongelamento, centrifugar os neurônios glutamatérgicos e astrócitos, aspirar o sobrenadante e ressuspender os dois tipos celulares separadamente em um mililitro de meio completo.
Misturar 20 microlitros da suspensão celular com o mesmo volume de azul de tripano e contar as células para determinar a concentração celular viável para cada tipo celular. Em seguida, combine 3 milhões de neurônios glutamatérgicos com 1 milhão de astrócitos em um tubo de 15 mililitros e adicione meios completos para fazer um volume final de oito mililitros. Centrifugar a suspensão celular e aspirar o sobrenadante sem perturbar o pellet.
Suspender o pellet em 200 microlitros de fluido ativador F299 pipetando para cima e para baixo. Coloque as tampas do cartucho e da placa de cultura e retire-as da bioimpressora. Em um gabinete de biossegurança, adicione 200 microlitros de suspensão celular ao poço C3 do cartucho de impressão.
Reinsira o cartucho na bioimpressora e remova a tampa conforme demonstrado anteriormente. Inicie o estágio de modelos de impressão da tiragem. Ao mesmo tempo, substitua a mídia laminada da placa de controle 2D por mídia completa.
Insira a placa de direcionamento de bioimpressão na bioimpressora e remova a tampa. Inicie o processo de segmentação de bioimpressão. Quando solicitado, remova a placa de direcionamento da bioimpressora.
Use o guia para identificar locais onde as gotículas podem ser observadas na placa. Reinsira a placa de direcionamento na bioimpressora para repetir o processo de impressão e seleção de gotículas. Quando solicitado, substitua a placa de destino por uma placa de cultura celular.
Após a impressão, adicione mídia completa a todos os poços de co-cultura 3D e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Por fim, descarte cartuchos e líquidos remanescentes. de acordo com os protocolos do laboratório.
Após sete dias de impressão, quase nenhuma célula única permaneceu e feixes interconectados de neuritos e projeções astrocitárias apareceram fortificados. O crescimento neurítico aumentou linearmente entre 12 e 156 horas. Durante o crescimento dos neuritos, os aglomerados do corpo celular também aumentaram de tamanho.
A análise da viabilidade celular mostrou que aproximadamente 72% do total de células estavam vivas no quarto dia, enquanto 29% estavam mortas. A imunomarcação confirmou a morfologia celular saudável dos neurônios bioimpressos e astrócitos, com ambos os tipos celulares exibindo crescimento de protrusões celulares. O fenótipo glutamatérgico dos neurônios foi confirmado através da imunomarcação para o receptor de glutamato 2.
