Comece a diluição da amostra de soro humano misturando cinco microlitros da amostra de soro com 120 microlitros de tampão de ensaio em uma placa de 96 poços. Diluir mais oito vezes misturando 10 microlitros da diluição inicial com 70 microlitros de tampão de ensaio. Agora, prepare 100 microlitros da mistura de contas contendo esferas acopladas ao antígeno alvo.
Em seguida, diluir a mistura de esferas preparada em 2,4 mililitros do tampão de ensaio em um tubo Falcon. Inicie a incubação do soro pipetando 25 microlitros da suspensão do cordão em poços designados. Adicione 25 microlitros de soro diluído 200 vezes nos poços com a suspensão de contas.
Cubra a placa de reação de 96 poços com um selo de microplaca. Em seguida, incube o prato com contas em um agitador de placa. Após a incubação, remova a placa de reação de 96 poços do agitador de placas.
Coloque a placa em uma lavadora de placa magnética e retire o selo da placa adesiva. Em seguida, lave as contas três vezes com 100 microlitros de tampão de lavagem e, em seguida, aspirar o volume final de lavagem das contas após a última etapa de lavagem. Para a primeira incubação de anticorpos, comece preparando uma nova mistura de reagentes de detecção dupla de IgG e IgM em tampão de ensaio.
Pipetar 30 microlitros do reagente de detecção em cada poço designado, em seguida, cobrir a placa de reação de 96 poços com um selo de microplaca. Incube a placa em um agitador de placas por 45 minutos a 20 graus Celsius a 750 rotações por minuto. Após a incubação, coloque a placa em uma lavadora de placas magnética e remova a pipeta de vedação da placa adesiva de 30 microlitros de striptavidin diluída marcada com BV421 em cada reação bem depois de lavar as placas como antes.
Em seguida, coloque a placa selada em um agitador de placas para posterior incubação. Uma vez concluída a incubação, lave a placa e ressuspenda as esferas dentro dos poços até um volume final de 100 microlitros usando o tampão de lavagem. Para analisar os resultados, cubra a placa de reação de 96 poços com um selo de microplaca.
Em seguida, incube a placa coberta por três minutos a 20 graus Celsius a 1000 rotações por minuto em um agitador de placa. Transfira a placa do agitador para o instrumento analisador de fluxo de repórter duplo. Finalmente, avalie a intensidade fluorescente mediana da amostra, ou MFI, seguindo as instruções do fabricante.
A análise de correlação de Spearman para três antígenos representativos de Borrelia demonstrou reprodutibilidade uniforme dos valores de IFM na detecção de anticorpos anti-Borrelia presentes em soros humanos. O ensaio de duplo repórter mostrou boa reprodutibilidade ensaio a ensaio com alta precisão interensaio demonstrada pelos gráficos de Levey-Jennings. Nas diluições das amostras de 100 a 12,800 vezes, as curvas de diluição para detecção de IgM e detecção de IgG foram semelhantes para ambos os instrumentos.
Os valores de IFM foram ligeiramente maiores no instrumento de repórter único.
