Constructing the 3D Human-Stem-Cell-Derived In Vitro Blood Brain Barrier

Montar a barreira hematoencefálica derivada de células-tronco pluripotentes humanas, ou iBBB, usando as células endoteliais dissociadas, parasitas e astrócitos, Combinar os três tipos de células em um tubo cônico, incluindo 10% mais do que o número calculado de células para explicar os erros de pipetagem. Gire a mistura celular a 300 g por três minutos. Aspirar o sobrenadante, deixando a célula granulada com aproximadamente 50 microlitros do meio.

Usando uma pipeta P200, ressuspenda suavemente o pellet de célula no meio residual para criar uma pasta de célula única. Coloque o tubo que contém a lama celular resultante no gelo e adicione uma quantidade suficiente de matriz de membrana basal GF reduzida a ele de acordo com o número desejado de iBBBs. Misture as células de forma homogénea, sem introduzir bolhas de ar.

Pipetar 50 microlitros da mistura de matriz celular resultante em um poço de uma placa de cultura de fundo de vidro de 48 ou 96 poços e distribuí-la uniformemente por todo o fundo da placa. Incubar a placa a 37 graus Celsius por 30 a 40 minutos para polimerizar a matriz enquanto encapsula as células. Por fim, adicione 500 microlitros de meio astrócito suplementado ao poço e mantenha os iBBBs em cultura.

Para uma placa de 96 poços, adicione 100 a 150 microlitros de meio ao poço até que estejam suficientemente desenvolvidos para ensaios a jusante, o que normalmente leva duas semanas. O iBBB adequadamente formado apareceu como um disco único e solidificado translúcido sob um microscópio de campo claro. Após 24 horas, células isoladas uniformemente distribuídas foram identificadas.

Após duas semanas, estruturas mais distintas, embora difíceis de definir, eram visíveis.