Para começar, rotule dois novos tubos de fax como tubos mistos um e dois. Preparar a suspensão de células e anticorpos de acordo com a tabela fornecida para análise por citometria de fluxo. Após incubar os tubos por 30 minutos, lavar cada tubo duas vezes com um mililitro de tampão de coloração.
Centrifugar os tubos de vórtice a 200 G durante 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de coloração. Revestir os poços de uma placa de 48 poços com 200 a 500 microlitros de FBS, e manter por uma hora.
Em seguida, pipetar 200 a 500 microlitros de meio MSC a 10% após a remoção do FBS residual. Para preparar as amostras para a classificação de célula única, pipete um mililitro de FBS em dois novos tubos de fax. Enrole os tubos para criar uma camada uniforme do FBS na superfície interna do tubo.
Preparar a suspensão de células e anticorpos em tubos mistos um e dois, conforme tabela, para o experimento de triagem. Em seguida, incube os tubos no escuro por 30 minutos à temperatura ambiente. Após lavagem com tampão de coloração, centrifugar os tubos a 200 G por 10 minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de coloração e incube por 15 minutos em cinco microlitros de DAPI antes da triagem. Para montar a matriz de compensação, utilize os tubos de compensação de mancha única. Clique em experimento na barra de ferramentas do software do instrumento.
Em seguida, clique em configuração de compensação, seguido de criar controles de compensação. Em seguida, clique no tubo não corado, seguido dos parâmetros na caixa de diálogo do citômetro. Ajuste as tensões editando os valores de cada parâmetro.
Clique em carregar no painel de aquisição e, em seguida, clique em adquirir. Arraste a porta P-1 para a população de células e aplique-a em todos os controles de compensação para definir a tensão e a porta negativa para cada parâmetro. Agora carregue os tubos de compensação de mancha única individualmente.
Registre os dados e salve-os. Selecione o experimento atual, clique com o botão direito do mouse sobre ele e selecione calcular valores de compensação, seguido de link e salvar. Execute o tubo misto um e grave 10.000 células.
Estabeleça as portas sobre a população de interesse para ser classificada com a estratégia de fechamento adequada. Em seguida, carregue uma placa de coleta no instrumento e defina um número de célula alvo, variando de 2.500 a 5.000 células por poço. Em seguida, selecione a máscara de pureza de classificação de célula única.
Coletar as populações de células classificadas em um dispositivo de coleta, mantendo-as no gelo durante o experimento de triagem. Finalmente, mude as placas para uma incubadora de dióxido de carbono a 5% para manter as culturas a 37 graus Celsius. Os ensaios multiparamétricos de citometria de fluxo não mostraram expressão do isotipo FITC dos anticorpos CD 90 FITC.
A expressão positiva dos marcadores CD-90 e CD-73 e a expressão negativa de CD-45 são comparáveis com a de seus controles não corados e FMO. Os fenótipos imunológicos mostraram a distribuição dos marcadores a partir de uma das passagens iniciais com os marcadores recomendados pela ISCT e CD-44, determinando as populações parentais como CTMs. Os galpões de passagem tardia foram utilizados para a classificação unicelular de expressores altos e fracos.
As células pós-selecionadas coletadas na placa de 48 poços mostraram aderência e proliferação, como sua população parental. As células pós-selecionadas diferenciaram-se na presença de fatores de crescimento adipogênicos.
