Realizar o isolamento de células de nicho limbal, ou LNCs, enquanto trabalha sob condições estéreis em uma bancada de trabalho ultralimpa. Recuperar o tecido do limbo do meio de armazenamento corneano de termo intermediário. Usando uma lâmina redonda cirúrgica estéril, raspe e remova a íris e o endotélio ao redor da córnea.
Em seguida, com a lâmina redonda cirúrgica estéril, corte o tecido do limbo em 12 pedaços iguais, deixando apenas um milímetro de tecido em ambos os lados da córnea e esclera. Depois disso, transfira os 12 pedaços de tecido do limbo para uma placa de cultura de 35 milímetros e adicione 1 mililitro de colagenase A para imergir completamente os tecidos na placa. Digerir os tecidos incubando a placa de cultura em uma incubadora de células de 37 graus Celsius por 18 horas.
Descongele a matriz matrigel ou de membrana basal em um refrigerador regulado a 4 graus Celsius. Prepare um saco esterilizado contendo pontas de 200 microlitros e 1 mililitro, um tubo centrífugo de 15 mililitros e um prato de 6 poços e coloque o saco a menos 20 ou 80 graus Celsius negativos por 20 minutos. Depois de recuperar as pontas, o tubo de centrífuga e 6 placas de poço do chiller, prossiga para executar as próximas etapas em uma bancada de trabalho ultralimpa.
Usando uma ponta pré-refrigerada de 200 microlitros, pipete 50 microlitros da matriz de membrana basal descongelada em 1 mililitro de MESCM e misture suavemente. Usando uma ponta pré-refrigerada de 1 mililitro encaixada em uma pipeta, transfira a matriz de membrana basal resultante de 5% para um único poço da placa de cultura de 6 poços pré-refrigerada. Agite suavemente a placa de poço 6 horizontalmente antes de colocá-la em uma incubadora a 37 graus Celsius por cerca de uma hora para preparar a placa de cultura revestida com 5% de matrigel.
Após a digestão de 18 horas, recuperar o tecido límbico digerido pela colagenase A, contendo principalmente pequenos aglomerados visíveis. Trabalhando sob um microscópio estéreo, use uma ponta de pipeta de 200 microlitros para separar os aglomerados dos tecidos esclerais não digeridos. Submergir os cachos destacados em EDTA-Tripsina 0,25% em uma placa de cultura de 35 milímetros e incubar a placa por 15 minutos.
Em seguida, adicione 1 mililitro de MESCM com 10% de soro nocaute à placa para extinguir a digestão celular. Pipetar suavemente a suspensão para cima e para baixo com uma ponta de pipeta de 1 mililitro para quebrar os cachos em células individuais. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifuga-a a 200 G por cinco minutos à temperatura ambiente.
Sem perturbar o pellet celular, remova cuidadosamente o sobrenadante e adicione 1 mililitro de MESCM para ressuspender as células. Usando uma ponta de pipeta de 1 mililitro, pipete o conteúdo para cima e para baixo duas a três vezes para garantir que todo o pellet seja ressuspenso no MESCM. Recolher 20 microlitros da suspensão para contagem de células.
Em seguida, usando uma pipeta de 1 mililitro, transfira a suspensão celular para a matriz de membrana basal de 5% revestida com 6 placas de poço. Adicione MESCM para fazer o volume total no poço 2,5 mililitros. Agite suavemente a placa de 6 poços horizontalmente para garantir uma distribuição uniforme das células.
Após a obtenção de imagens das células, transfira-as para uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius. O protocolo demonstrado digeriu com sucesso o tecido da borda escleral da córnea, gerando aglomerados que puderam ser visualizados ao microscópio. Como esperado, os cachos lembravam a forma de uma lagarta.
Os NCNs primários cresceram lentamente e necessitaram de aproximadamente 12 dias para cultivo. Os LNCs da passagem 1 para a passagem 8 precisaram de cerca de três dias para passar, mas a taxa de crescimento dos LNCs após a passagem 9 diminuiu significativamente. Morfologicamente, os NCL eram fusiformes e redondos na passagem 0.
Após a passagem 3, passaram a ter fuso e tamanhos uniformes. O número de duplicações celulares ou DCNT representou a taxa de crescimento dos NCNs. As curvas de DCNT e DCNT acumuladas revelaram que os NCN cresceram mais rapidamente da passagem 3 para a passagem 5.
