Usando uma pipeta sorológica, coloque cuidadosamente quatro mililitros de sangue humano heparinizado sobre oito mililitros de meio de gradiente de densidade em um tubo centrífugo de 15 mililitros. Centrifugar o sangue a 550G durante 30 a 50 minutos a 20 graus Celsius. Em seguida, use uma pipeta de um mililitro para remover a camada superior contendo plasma e células mononucleares.
Coletar neutrófilos da faixa turva inferior e aproximadamente três a quatro mililitros abaixo do líquido claro em um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo 10 mililitros de PBS. Inverta suavemente o tubo duas a três vezes para misturar a suspensão de neutrófilos. Centrifugar a suspensão de neutrófilos a 400G por 10 minutos a 20 graus Celsius, depois decantar cuidadosamente o sobrenadante do tubo e ressuspender o pellet em cinco mililitros de PBS.
Novamente, centrifugar a suspensão a 300G por 10 minutos a 20 graus Celsius. Depois de remover o sobrenadante, use sucção a vácuo para eliminar o sobrenadante residual na parede do tubo e ao redor da boca do tubo. Ressuspender o pellet em um mililitro de meio neutrófilo.
Combine um mililitro de solução de anticorpos de 1,2 microgramas por mililitro com 0,2 mililitros de meio neutrófilo em um tubo de 1,5 mililitro. Adicionar 25 microlitros de solução de anticorpos aos poços de controle negativo em uma placa de 384 poços. Em um tubo de 15 mililitros, combinar nove mililitros da solução de anticorpos, 21,6 microlitros da solução FMLP e 1,7784 mililitros de meio neutrófilo.
Adicione 25 microlitros dessa mistura aos poços de controle positivo e teste em uma placa de 384 poços. Usando uma pipeta multicanal, transfira cinco microlitros de solução composta da placa de biblioteca composta para a placa de 384 poços. Centrifugar a suspensão a 500G por um minuto.
Adicione 20 microlitros de suspensão de neutrófilos a cada poço usando uma pipeta de 16 canais. Incubar a placa em um agitador a 300 RPM por 10 minutos. Em seguida, para fixar as células, adicione três microlitros de paraformaldeído a 16% em cada poço e incube no gelo por 10 minutos.
