Para começar, pré-aqueça uma quantidade adequada de meios de cultura estéreis enquanto o pré-tratamento de 48 horas com dexametasona do explante murino dos membros posteriores está prestes a ser concluído. Terminado o pré-tratamento, mova os explantes pré-tratados para o gabinete de biossegurança. Para o grupo descarregado, aspirar o meio de pré-tratamento e transferir os explantes para placas de Petri frescas.
Adicione 70 mililitros de meios de cultura a cada prato antes de devolvê-los à incubadora. Para preparar as plataformas de explante para o grupo de tensão basal e impacto estático, corte pedaços de lixa para corresponder ao tamanho das placas de aderência. Para o grupo de impacto estático, corte pedaços de linha trançada e amarre um nó overhand solto no meio do comprimento da linha.
Rasgue pedaços de papel alumínio para cobrir cada banho de acrílico e borrife com etanol 70%. Transfira os componentes preparados para o gabinete de biossegurança. Organize os componentes como banho de acrílico, base, insertos de redução de volume, grampo e pegas para montagem da plataforma.
Coloque os componentes da plataforma dentro de recipientes secundários de volume suficiente para conter possíveis vazamentos de meios de cultura. Submergir os recipientes em uma solução de pelo menos 10% de água sanitária por um período mínimo de uma hora. Enxágue as soluções de água sanitária com água da torneira.
Após transferir os componentes enxaguados para o gabinete de biossegurança, utilize parafusos M3 e molas de compressão para fixar as placas nas alças. Fixe firmemente as alças à base empregando um parafuso M5 e insira os parafusos M6 até que entrem em contato com as placas. Melhore a funcionalidade das placas afixando lixas usando fita dupla face.
Feche as alças para facilitar a aderência da lixa às placas. Para carregar uma plataforma, abra totalmente as alças e use pinças para posicionar cuidadosamente a parte superior da perna e o joelho entre as placas. Feche as alças suavemente para manter o membro no lugar.
Use a pinça para agarrar a cabeça ou o pé femoral exposto e ajuste o ângulo de flexão do joelho, fechando gradualmente a pinça para prendê-la no lugar. Para o grupo de tensão basal, estenda a articulação do joelho enquanto fecha as pegas. No caso do grupo de impacto estático, flexione a articulação do joelho enquanto fecha as pegas.
Para o grupo de impacto estático, coloque o nó overhand da corda ao redor da pata distal e aperte-a com segurança. Direcione a corda através de um slot na base abaixo do explante e através do orifício do clipe. Posicione a base no banho de acrílico e prenda o clipe na borda superior do banho.
Para dorsiflexar o pé, puxe a corda até atingir pelo menos 110 graus em relação à tíbia. Use um marcador permanente para marcar a cadeia de caracteres ao sair do clipe. Capturar uma fotografia do explante nesta posição dorsiflexionada para futura quantificação do ângulo de dorsiflexão.
Remova a base da configuração e conecte a pastilha de redução de volume deslizando-a ao longo de uma esteira na base. Coloque a base de volta no banho de acrílico e reposicione o clipe na borda superior. Use a cadeia de caracteres marcada como guia.
Puxe-o para restaurar o pé ao seu ângulo de dorsiflexão original e prenda a corda ao exterior do banho usando fita adesiva para manter uma posição dorsiflexada estática. Para o grupo de tensão basal, uma vez posicionado o explante entre as pegas, fotografe para quantificar o ângulo de dorsiflexão. Em seguida, deslize a pastilha de redução de volume sobre a base e coloque-a no banho de acrílico.
Adicione 125 mililitros de meios de cultura pré-aquecidos a cada plataforma para submergir os explantes. Depois de cobrir a parte superior do banho com papel alumínio, coloque todo o setup em um recipiente secundário. Realocar o recipiente secundário para a incubadora e cultura por sete dias.
