Para iniciar a colheita da medula óssea, mergulhe um rato eutanasiado em etanol 75% para esterilizar o pelo e a pele. Deite o rato de costas e corte os membros inferiores no quadril para proteger a cabeça do fêmur. Use tesoura de dissecção para cortar o ligamento na articulação do hock.
Em seguida, dobre a articulação do joelho para trás para expor o fêmur e a tíbia. Com um par de pinças e tesouras, remova cuidadosamente quaisquer músculos, tendões e outros tecidos conectados aos ossos. Cutuque a medula através de ambas as extremidades ósseas com uma seringa agulhada de 5 milímetros para soltar a matriz da medula.
Agora use uma seringa fresca para limpar a medula óssea com 10-15 mililitros de mídia RPMI. Centrifugar as células da medula óssea a 300G por 10 minutos a 20 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 5-10 mililitros de tampão de lise de hemácias.
Após incubar a suspensão, adicionar quatro vezes o volume de HBSS à mistura. Em seguida, centrifugar as células a 600G por cinco minutos à temperatura ambiente. Use o pellet resultante para uso posterior.
Isole os neutrófilos primeiro com kit de isolamento de neutrófilos de medula óssea de ratos. Camada 2 mililitros de 80-55% por col reagente em um tubo centrífugo de 15 mililitros, para criar um gradiente de densidade. Em seguida, pipetar os neutrófilos isolados, ou a solução de ressuspensão de células isoladas com kit de isolamento de neutrófilos de medula óssea de rato, para dentro do tubo.
Centrifugar o tubo a 800G durante 40 minutos a 20 graus Celsius. Com uma pipeta estéril, colete a camada de gradiente de 70%, incluindo as camadas de células no limite de 65-70%. Transfira a suspensão da célula para um novo tubo centrífugo de 15 mililitros.
Adicione 15 mililitros de HBSS no tubo e inverta suavemente para misturar seu conteúdo. Finalmente, centrifugar o tubo a 300G por 10 minutos à temperatura ambiente para pellet das células. Para o processo de uma etapa, após pipetar a suspensão da medula óssea diretamente no tubo de gradiente de densidade, centrifugar como demonstrado anteriormente.
Em seguida, pipete a camada de gradiente de 70%, incluindo as camadas no limite de gradiente de 75-70%. Transfira esta suspensão celular para um novo tubo centrífugo de 50 mililitros com 10 mililitros de HBSS. Em seguida, centrifugar o tubo a 400G por cinco minutos à temperatura ambiente para peletizar as células.
Contar os neutrófilos isolados usando um hemocitômetro e avaliar a viabilidade celular através da coloração com azul de tripano. O método de duas etapas teve um nível de pureza aumentado de 90% em relação aos 50% alcançados pelo método de uma etapa.
