Para começar, pipetar 50 microlitros das amostras isoladas de ratos NET para um tubo com 450 microlitros de tampão Tris-EDTA. Agora pipetar 100 microlitros dos padrões de DNA e as amostras em uma placa de 96 poços. Adicione um volume igual de reagente de ensaio nos poços.
Em seguida, incubar a placa em temperatura ambiente por dois a cinco minutos, evitando a exposição à luz direta. Coloque a placa em um leitor de microplacas de fluorescência. Defina um espectro de emissão de cerca de 530 nanômetros e um espectro absorvente de cerca de 480 nanômetros.
Incubar as células em um microlitro de uma mancha nuclear por 30 minutos. Em seguida, incube as células em um microlitro de cepa de DNA livre de células por 10 minutos. Misture suavemente os corantes fluorescentes.
Coloque a placa de amostra no citômetro. Alterne para o canal SYTOX Green e selecione o canal HEXT. Ajuste a iluminação para azul 377/447 e ajuste o tempo de exposição para 300.000 microssegundos.
Clique em Configuração focada e, em seguida, clique em Registrar automaticamente para ajustar automaticamente o foco. Selecione o canal verde SYTOX e defina a iluminação como verde 483/536. Defina o tempo de exposição do SYTOX Green para 30.000 microssegundos.
Clique em Iniciar varredura para iniciar o processo de digitalização. Respostas comparáveis na secreção de NET foram discerníveis entre neutrófilos periféricos e da medula óssea, independentemente da estimulação de PMA. As redes de ratos também exibiram capacidades limitadas de ligação cruzada entre si.
A incubação com PMA levou a um aumento de 10% no conteúdo de DNA livre de células após quatro horas, indicando uma maior propensão para desencadear a formação de NET.
