Para realizar a extração de DNA, primeiro adicione uma quantidade apropriada de solução de lise celular ao pellet celular obtido do humor ocular. Pipetar a solução para cima e para baixo para misturá-la completamente. Uma vez que as células estão totalmente lisadas, adicione uma solução de precipitado de proteína para compor um terço do volume total.
Agora, vórtice e misture vigorosamente por 20 a 30 segundos. Em seguida, gire por três minutos a 3000g em temperatura ambiente. Enquanto isso, transfira 300 microlitros de isopropanol para um tubo de microcentrífuga limpo.
Uma vez concluída a centrifugação, pipetar cuidadosamente o sobrenadante para o tubo contendo isopropanol. Em seguida, adicione 1,5 microlitros de glicogênio ao tubo e inverta o tubo para misturar completamente. Coloque o tubo a menos 20 graus Celsius em um freezer por uma hora ou durante a noite para facilitar a precipitação de DNA.
Após o congelamento, centrifugar o tubo em cinco minutos a 3000g à temperatura ambiente. Em seguida, pipetar o isopropanol. Para lavar o pellet, adicione 0,5 mililitros de etanol 70%.
Inverta o tubo suavemente para garantir uma lavagem uniforme. Em seguida, gire o tubo por um minuto a 3000g à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante do tubo da centrífuga.
Agora, inverta o tubo em gaze limpa para drenar a solução e secar o pellet. Após um giro rápido na microcentrífuga, use uma ponta de pipeta descartável de ponta fina para pipetar a gota de etanol restante. Em seguida, adicione 45 microlitros de solução de hidratação de DNA ao pellet de DNA seco.
Em seguida, coloque o tubo em um bloco de aquecimento regulado para 50 graus Celsius. Os rendimentos de DNA de ambos os componentes celulares e livres de células dos fluidos oculares foram semelhantes. Foi realizada análise por PCR dos componentes celulares e livres de células de uma mutação associada ao linfoma vitreorretiniano.
Uma maior taxa de mutação estava presente no componente livre de células, como demonstrado por um limiar de ciclo reduzido.
