Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

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November 10th, 2023

DOI :

10.3791/200882-v

November 10th, 2023

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Christina M. Kaszuba¹^,², Benjamin J. Rodems¹^,³, Sonali Sharma¹^,³, Edgardo I. Franco¹^,², John M. Ashton¹^,³^,⁴, Laura M. Calvi¹^,⁵, Jeevisha Bajaj¹^,³

¹Wilmot Cancer Institute, University of Rochester Medical Center, ²Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, ³Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, ⁴Genomics Research Center, University of Rochester Medical Center, ⁵Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Rochester Medical Center

Transcrição

Para começar, remova o tecido dos ossos do camundongo dissecado eutanasiado. Coloque os ossos limpos em uma nova placa de seis poços contendo tampão FACS colocado no gelo. Transfira os ossos para uma argamassa com dois a cinco mililitros de tampão FACS.

Triture os ossos em um movimento circular até que a medula óssea seja liberada. Com uma seringa de três mililitros, puxe para cima e lave a medula óssea para homogeneizá-la. Puxe o homogeneizado para outra seringa e, em seguida, filtre-o através de um filtro de células de 70 micrômetros em um tubo de 50 mililitros.

Enxaguar os pedaços de tecido de seu filtro de volta para a argamassa com tampão FACS antes de homogeneizar uma segunda vez. Filtre o tecido enxaguado como antes. Em seguida, enxágue as espículas ósseas restantes de volta na argamassa com tampão FACS.

Em seguida, lave as peças em um tubo de 15 mililitros para garantir o máximo rendimento. Para digerir a medula óssea, primeiro centrifuga-a a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda a pelota de medula óssea em dois mililitros de mistura de digestão.

Transfira a mistura para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, incube-o a 37 graus Celsius por 45 minutos em um rotador. Agora, adicione 10 mililitros de tampão FACS para interromper a digestão enzimática.

Filtre a mistura através de um filtro de células de 70 micrômetros em um tubo de 50 mililitros. Centrifugar a suspensão a 400 G durante sete minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de lise eritrocitária.

Em seguida, adicione 10 mililitros de tampão FACS para interromper a lise. Em seguida, filtre a mistura como antes em um tubo de 50 mililitros. Por fim, centrifugar a mistura a 300 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Após o descarte do sobrenadante, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão FACS. Para a digestão das espículas ósseas, primeiro, vórtice as espículas ósseas. Decantar o sobrenadante e reter os ossos na parte inferior.

Em seguida, ressuspenda as espículas em um mililitro da mistura de digestão de espículas ósseas. Incubar o tubo em um rotador por 60 minutos a 37 graus Celsius. Finalmente, pare a digestão com 10 mililitros de tampão FACS.

Filtrar a mistura para o tubo de 50 mililitros contendo a medula óssea lisada e digerida por hemácias.

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