Agradecemos ao Núcleo de Citometria de Fluxo da URMC. Este trabalho foi apoiado pela American Society of Hematology Scholar Award, Leukemia Research Foundation award e NIH grants R01DK133131 and R01CA266617 concedido a J.B.

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Recursos Animais da Universidade de Rochester. Os camundongos foram criados e mantidos nas instalações de cuidados com animais da Universidade de Rochester. Para modelar a SMD de alto risco, o modelo murino NHD13 comercialmente disponível19 é empregado. Neste modelo, as células estromais da medula óssea são analisadas em camundongos NHD13 fêmeas com 8 semanas de idade, antes do início da doença. De novo A LMA é gerada conforme previamente descrito 6,11,20. Os oncogenes usados para induzir LMA, como MLL-AF9 e NRas, são marcados com GFP ou YFP, permitindo a análise das populações não leucêmicas de GFP- medula óssea usando citometria de fluxo. Em resumo, camundongos fêmeas C57BL/6J de 10 semanas de idade são transplantados com células murinas GFP/YFP+ AML, e a medula óssea é colhida 2 semanas após o transplante. Enquanto camundongos fêmeas são usados neste estudo para fins de demonstração, este protocolo pode ser conduzido com camundongos machos ou fêmeas. Também pode ser realizado usando um fêmur ou todos os ossos longos.
1. Colheita de medula óssea
NOTA: Para detalhes sobre o protocolo de dissecção dos animais, consulte Amend et al.26.
<ol><li>Limpar a argamassa e o pilão com etanol 70%, enxaguar com tampão FACS resfriado (Tabela 1) e colocá-los no gelo para esfriar antes de iniciar a colheita. Além disso, coloque o tampão MACs (Tabela 1) na bancada para permitir que ela atinja a temperatura ambiente.</li>
	<li>Eutanasiar o animal seguindo as orientações e protocolos institucionais de cuidados e uso dos animais.</li>
	<li>Na bancada, borrife bem o rato com etanol a 70% até molhar o pelo. Usando pinça e tesoura curva, levante a pele sobre o abdômen e faça duas incisões de aproximadamente 0,5 mm de comprimento em ambos os lados do mouse, lateralmente do abdômen. Em seguida, faça uma incisão de 0,5 mm distal ao abdome. Puxe para baixo para remover a pele e o pelo das pernas do rato.</li>
	<li>Coloque uma tesoura perpendicular à pelve, pressione para baixo enquanto puxa o fêmur com pinças. A cabeça femoral deve se desprender da pelve. Separe o fêmur e a tíbia na articulação patelofemoral. Coloque os ossos em tampão FACS em uma placa de 6 poços sobre gelo.</li>
	<li>Remova o tecido dos ossos usando tecido de nível laboratorial e coloque os ossos limpos em uma nova placa de 6 poços com tampão FACS fresco no gelo.</li>
	<li>Coloque todos os ossos na argamassa com 2-5 mL de tampão FACS para que todos os ossos fiquem imersos no tampão (ajuste o volume do tampão com base em quantos ossos você está processando). Esmague e triture os ossos usando o pilão em movimento circular até que o tecido da medula óssea seja liberado.</li>
	<li>Com uma seringa de 3 mL, homogeneizar a medula óssea puxando para cima e lavando o líquido da argamassa.</li>
	<li>Usando uma seringa de 3 mL, puxe o líquido da argamassa e filtre-o através de um filtro de células de 70 μm em um tubo de 50 mL sobre gelo. Enxaguar os pedaços de osso/tecido do filtro de volta para a argamassa com tampão FACS e retornar ao passo 1.7 para homogeneizar e coar uma segunda vez. Esta constitui a fração da medula óssea.</li>
	<li>Enxaguar os pedaços ósseos restantes (espículas) de volta na argamassa com tampão FACS e lavá-los em um tubo de 15 mL usando tampão FACS para garantir o máximo rendimento celular. Esta é a fração das espículas ósseas.</li>
</ol>2. Digestão da medula óssea
<ol><li>Centrifugar a medula óssea a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Decantar e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender a medula óssea em 2 mL da mistura de digestão da medula óssea (Tabela 1) e transferi-la para um tubo de 15 mL. Incubar a 37 °C durante 45 min num rotador.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de tampão FACS para interromper a digestão enzimática. Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 μm para um novo tubo de 50 ml.</li>
	<li>Pellet a mistura a 400 x g durante 7 min a 4 °C.</li>
	<li>Ressuspender a pastilha de medula óssea em 1 mL de tampão de lise eritrocitária (ver Tabela de Materiais). Incubar por 4 min no gelo.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de tampão FACS para interromper a lise. Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 μm para um novo tubo de 50 ml.</li>
	<li>Pellet a mistura a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão FACS.</li>
</ol>3. Digestão das espículas ósseas
<ol><li>Vórtice as espículas ósseas a partir do passo 1.9 e deixe-as assentar. Decantar o sobrenadante e reter o osso na parte inferior.</li>
	<li>Ressuspender as espículas ósseas em 1 mL da mistura de digestão da espícula óssea (Tabela 1).</li>
	<li>Colocar os tubos num rotador de tubo durante 60 minutos a 37 °C.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de tampão FACS para interromper a digestão enzimática. Filtrar a mistura através de um filtro celular de 70 μm para o tubo de 50 mL contendo medula óssea lisada e digerida por hemácias.</li>
</ol>4. Coloração
<ol><li>Misture suavemente as espículas ósseas e a suspensão de células da medula óssea.</li>
	<li>Utilizar 10 μL da suspensão celular para contar o número de células vivas em um hemocitômetro utilizando coloração à base de azul de Tripano 0,4%, conforme descrito em protocolos publicados27. Coletar 50.000 células para um controle sem manchas da suspensão celular.</li>
	<li>Centrifugar as células restantes a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Retire o sobrenadante e ressuspenda-o em 100 μL de tampão FACS. NOTA: Os anticorpos podem ser titulados para determinar a diluição ideal. A seleção de anticorpos (epítopos e fluorocromos) pode ser personalizada.</li>
	<li>Para coloração com anticorpos para depleção magnética, adicionar FC Block (1 μL por 25 x 106 células), CD45-APC (10 μL por 25 x 106 células) e Ter119-APC (4 μL por 25 x 106 células) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Incubar no gelo por 20 min. Lavar com tampão FACS, remover 50.000 células (~50 μL) para o controle corado com APC, centrifugar a 300 x g por 5 min a 4 °C e ressuspender em 100 μL de tampão FACS.</li>
	<li>Para coloração da suspensão celular com microesferas para depleção magnética, adicionar mIgG (8 μL por 25 x 106 células) e microesferas Anti-APC (20 μL por 25 x 106 células) (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Incubar no gelo por 20 min. Lavar com 10 ml de tampão FACS, centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
</ol>5. Depleção da amostra por triagem magnética
NOTA: Esta etapa é realizada usando um separador magnético manual disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante. Esta etapa também pode ser executada com um separador automatizado (consulte a Tabela de Materiais).
<ol><li>Preparar a coluna DL lavando-a com 2 mL de tampão MACs (Tabela 1). Descarte o efluente e troque o tubo coletor.</li>
	<li>Ressuspenda até 1 x 108 células em tampão MACs e filtre-as através de um tubo de ensaio de 5 mL com uma tampa de filtro de células de 35 μm.</li>
	<li>Coloque a coluna LD no suporte do separador magnético. Posicionar um tubo de ensaio de 5 ml abaixo da coluna para recolher o eluato.</li>
	<li>Adicione a suspensão da célula à coluna LD preparada. Permitir que a fração negativa flua para o tubo de coleta. Lavar a coluna duas vezes com 1 mL de tampão MACs, coletando o eluato no mesmo tubo. Esta é a fração negativa usada na etapa 5.6 abaixo.</li>
	<li>Retire a coluna LD do suporte do separador magnético e coloque-a num novo tubo de ensaio de 5 ml. Use uma pipeta para distribuir 3 mL de tampão na coluna para liberar as células que foram marcadas positivamente, usando o êmbolo de coluna.</li>
	<li>Centrifugar as fracções negativa e positiva a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspendê-los em 100 μL de tampão FACS.</li>
	<li>Contar 10 μL das frações negativa e positiva com 0,4% de azul de Tripano. Os volumes para a coloração do painel endotelial abaixo serão baseados nesta contagem celular.</li>
	<li>Use 50.000 células vivas da fração positiva para controles de contagem de citometria de fluxo.</li>
</ol>6. Osteoanálise/coloração do painel endotelial
NOTA: A compensação deve ser realizada seguindo os protocolos padrão de citometria de fluxo, incluindo todos os controles apropriados de coloração e limitação.
<ol><li>Para coloração da fração negativa CD45/Ter119 (1 μL de cada anticorpo por 1 x 106 células), adicionar CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE e CD140a-PE-Cy5 (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Incubar no gelo por 20 min. Lavar com 2 ml de tampão FACS e, em seguida, centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a 4 °C.</li>
	<li>Adicionar 1 ml de tampão FACS e uma diluição de 1:1000 de IP para coloração viva/morta e, em seguida, filtrar a amostra através de um tubo de ensaio de 5 ml com uma tampa de filtro de células de 35 μm.</li>
	<li>Analise as células em um citômetro de fluxo multicolorido.</li>
</ol>

Isolamento e caracterização do microambiente da medula óssea em neoplasias mieloides

<ol>
	<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Boulais, P. E., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+of+hematopoietic+stem+cell+niches.">Making sense of hematopoietic stem cell niches.</a> Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).</li><li>Pinho, S., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+activity+and+interactions+with+the+niche.">Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).</li><li>Kfoury, Y., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+contributions+to+the+stem+cell+niche.">Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).</li><li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis.">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li><li>Bajaj, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd98-mediated+adhesive+signaling+enables+the+establishment+and+propagation+of+acute+myelogenous+leukemia.">Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia.</a> Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).</li><li>Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia+stem+cells+and+microenvironment:+Biology+and+therapeutic+targeting.">Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting.</a> J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).</li><li>Kim, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+notch+activation+in+microenvironment+leads+to+myeloproliferative+disease.">Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease.</a> Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).</li><li>Walkley, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microenvironment-induced+myeloproliferative+syndrome+caused+by+retinoic+acid+receptor+gamma+deficiency.">A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency.</a> Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).</li><li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+&#946;-catenin+mutation+in+osteoblasts.">Leukaemogenesis induced by an activating &#946;-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li><li>Hanoun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myelogenous+leukemia-induced+sympathetic+neuropathy+promotes+malignancy+in+an+altered+hematopoietic+stem+cell+niche.">Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche.</a> Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).</li><li>Raaijmakers, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia.">Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li><li>Frisch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+inhibition+of+osteoblastic+cells+in+an+in+vivo+mouse+model+of+myeloid+leukemia.">Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia.</a> Blood. 119 (2), 540-550 (2012).</li><li>Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+cancer+initiation+and+progression.">Stem cells in cancer initiation and progression.</a> J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).</li><li>Sekeres, M. A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+treatment+of+myelodysplastic+syndromes:+A+review.">Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review.</a> Jama. 328 (9), 872-880 (2022).</li><li>Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshot:+Acute+myeloid+leukemia.">Snapshot: Acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).</li><li>Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mll+translocations,+histone+modifications+and+leukaemia+stem-cell+development.">Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development.</a> Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).</li><li>Yoshimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+alterations+in+rna+splicing+and+epigenetic+regulation+drive+leukaemogenesis.">Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis.</a> Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).</li><li>Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup98-hoxd13+transgenic+mice+develop+a+highly+penetrant,+severe+myelodysplastic+syndrome+that+progresses+to+acute+leukemia.">Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia.</a> Blood. 106 (1), 287-295 (2005).</li><li>Kwon, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+3+is+required+for+the+development+and+propagation+of+acute+myelogenous+leukemia.">Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).</li><li>Bajaj, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+genome-wide+crispr+screen+identifies+the+rna-binding+protein+staufen2+as+a+key+regulator+of+myeloid+leukemia.">An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia.</a> Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+mll-af9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Baryawno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+taxonomy+of+the+bone+marrow+stroma+in+homeostasis+and+leukemia.">A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia.</a> Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).</li><li>Tikhonova, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+microenvironment+at+single-cell+resolution.">The bone marrow microenvironment at single-cell resolution.</a> Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).</li><li>Balderman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+bone+marrow+microenvironment+improves+outcome+in+a+murine+model+of+myelodysplastic+syndrome.">Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 127 (5), 616-625 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> JoVE. 110, e53936 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> , (2023).</li><li>Passaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+vascular+permeability+in+the+bone+marrow+microenvironment+contributes+to+acute+myeloid+leukemia+progression+and+drug+response.">Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response.</a> Blood. 128 (22), 2662 (2016).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+factor+is+selectively+secreted+by+arterial+endothelial+cells+in+bone+marrow.">Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow.</a> Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).</li><li>Baccin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+and+spatial+transcriptomics+reveal+the+molecular,+cellular+and+spatial+bone+marrow+niche+organization.">Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization.</a> Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).</li><li>Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+digestion+strategies+on+characteristics+and+differentiation+potential+of+human+dental+pulp+stem+cells.">Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells.</a> Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).</li><li>Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+IV+in+normal+skin+and+in+pathological+processes.">Collagen IV in normal skin and in pathological processes.</a> N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Modelos de leucemia murina têm sido extensivamente utilizados para identificar sinais intrínsecos e de nicho celular que promovem progressão agressiva da leucemia mieloide 6,19,21. Aqui, um protocolo abrangente baseado em citometria de fluxo para definir a composição celular do microambiente da medula óssea em modelos murinos de SMD e LMA é apresentado.
Antes de adquirir dados de citometria de ...

O microambiente da medula óssea é constituído por células hematopoéticas, células estromais não hematopoéticas e matrizextracelular1,2. Esse microambiente pode promover a auto-renovação das células-tronco hematopoéticas, regular a diferenciação de linhagens e fornecer suporte estrutural e mecânico ao tecido ósseo1,2,3,4,5. O nicho estromal inclui células de osteolinhagens, fibroblastos, células nervosas e células endoteliais6, enquanto o nicho hematopoiético é constituídopelas populações linfoide e mielóide1,2,3. Além de suportar CTHs normais, o microambiente da medula óssea também pode desempenhar um papel no desenvolvimento de desordens de células-tronco hematopoéticas, como SMD e LMA7,8,9,10,11. Demonstrou-se que mutações em células de osteolinhagens promovem o desenvolvimento de SMD, LMA e outras neoplasias mieloproliferativas 10,12,13,14.
As síndromes mielodisplásicas são um grupo de doenças pré-leucêmicas que surgem a partir de mutações em células-tronco hematopoéticas. A SMD está frequentemente associada a um bloqueio na diferenciação das CTH e à produção de células displásicas, o que muitas vezes pode levar à falência da medula óssea. A SMD é a neoplasia mieloide mais comumente diagnosticada nos Estados Unidos e está associada a uma taxa de sobrevida de 3 anos de 35%-45%15. A SMD está frequentemente associada a um alto risco de transformação para leucemia mieloide aguda. Isso pode ser uma complicação fatal, já que a LMA derivada da SMD é resistente à maioria das terapias e tem probabilidade de recidiva. A LMA que surge de novo devido a translocações ou mutações no tronco hematopoético e progenitores também é frequentemente resistente à quimioterapia padrão16,17. Como a SMD e a LMA são principalmente doenças de idosos, sendo a maioria diagnosticada acima de 60 anos, a maioria dos pacientes não é elegível para transplante curativo de medula óssea. Há, portanto, uma necessidade significativa de identificar novos reguladores da progressão da doença. Uma vez que o microambiente da medula óssea pode fornecer suporte para célulasmalignas14, a definição de alterações no nicho medular com a progressão da doença pode levar à identificação de novas terapêuticas que visem inibir o remodelamento do nicho tumoral. Há, portanto, uma necessidade significativa de identificar novos reguladores da progressão da doença. Para tanto, é fundamental identificar e caracterizar alterações nas populações de células estromais da medula óssea que possam dar suporte às células malignas.
Vários modelos murinos de LMA e SMD foram gerados e podem ser usados para estudar alterações no microambiente da medula óssea durante o início e progressão da doença 6,1,19,20,21,22. Neste estudo, são descritos protocolos para identificar alterações nas populações de células estromais da medula óssea utilizando modelos murinos deLMA induzida retroviricamente6,20, bem como o modelo Nup98-HoxD13 (NHD13) comercialmente disponível de MDS de alto risco para transformação de LMA19. Camundongos transplantados com células de novo da LMA sucumbem à doença em 20-30 dias6. Os camundongos NHD13 desenvolvem citopenias e displasia da medula óssea em torno de 15-20 semanas, que eventualmente se transforma em LMA, e quase 75% dos camundongos sucumbem à doença em torno de 32 semanas. Para analisar as populações do microambiente da medula óssea modelo murino, os ossos são colhidos, a medula óssea e as espículas ósseas são digeridas usando digestão enzimática, e as células são então enriquecidas para populações não-hematopoiéticas CD45-/Ter119- por classificação magnética. Embora análises semelhantes tenham sido descritas anteriormente 11,13,22,23,24,25, elas frequentemente se concentram na medula óssea ou no osso e não incorporam células de ambas as fontes em suas análises. A caracterização combinada dessas populações, em conjunto com análises de expressão gênica, pode fornecer uma compreensão abrangente de como o microambiente hematopoético celular fornece suporte para o início e progressão da doença (Figura 1). Embora o protocolo descrito abaixo se concentre no modelo de LMA induzida retroviricamente e em um modelo genético de SMD, essas estratégias podem ser facilmente adaptadas para estudar alterações no nicho da medula óssea de qualquer modelo murino de interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL pipette Tips&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>AVANT</td>
			<td>L211511-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette Tips</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-140RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Vacuum Filtration Flask</td>
			<td>NEST</td>
			<td>344021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Aspirating Pipette</td>
			<td>NEST</td>
			<td>325011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette Tips</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-150-RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube&#160; 12 x 75 mm style</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>4425745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>66.000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>404-5981</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide Gas Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25-0311-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-0451-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m Nylon&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-63100-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>7415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Mini Centrifuge</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Stripettor Ultra Pipet Controller</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>117105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1x RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foundation B Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson&#160;PIPETMAN L Pipette Starter Kits</td>
			<td>FisherScientific&#160;</td>
			<td>F167370G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) 10x</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>BINDER</td>
			<td>C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>K222101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Vortex Mixer</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII/Fortessa/Symphony A1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>647800L6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MULTI STAND&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACsmix Tube Rotator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIgG</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>18765-10mg</td>
			<td>2 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td>010505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104106</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135920</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastipak 3 mL Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS&#160; Separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75009521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-5921-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying bone marrow microenvironmental populations in myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia

O microambiente da medula óssea consiste em populações celulares distintas, como células estromais mesenquimais, células endoteliais, células osteolinhagens e fibroblastos, que fornecem suporte para células-tronco hematopoéticas (CTHs). Além de suportar as CTHs normais, o microambiente da medula óssea também desempenha um papel no desenvolvimento de doenças de células-tronco hematopoéticas, como síndromes mielodisplásicas (SMD) e leucemia mieloide aguda (LMA). Mutações associadas à SMD em HSCs levam a um bloqueio na diferenciação e falência progressiva da medula óssea, especialmente em idosos. A SMD pode frequentemente evoluir para LMA resistente à terapia, uma doença caracterizada por um rápido acúmulo de blastos mieloides imaturos. Sabe-se que o microambiente da medula óssea está alterado em pacientes com essas neoplasias mieloides. Aqui, um protocolo abrangente para isolar e caracterizar fenotipicamente células microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndrome mielodisplásica e leucemia mieloide aguda é descrito. Isolar e caracterizar as alterações nas populações de nicho da medula óssea pode ajudar a determinar seu papel na iniciação e progressão da doença e pode levar ao desenvolvimento de novas terapêuticas direcionadas a alterações promotoras de câncer nas populações estromais da medula óssea.

The bone marrow microenvironment consists of hematopoietic cells, non-hematopoietic stromal cells, and the extracellular matrix1,2. This microenvironment can promote hematopoietic stem cell self-renewal, regulate lineage differentiation, and provide structural and mechanical support to the bone tissue1,2,3,4,5. The stromal niche includes osteolineage cells, fibroblasts, nerve cells, and endothelial cells6, while the hematopoietic niche consists of the lymphoid and myeloid populations1,2,3. In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment can also play a role in the development of hematopoietic stem cell disorders such as MDS and AML7,8,9,10,11. Mutations in osteolineage cells have been shown to promote the development of MDS, AML, and other myeloproliferative neoplasms10,12,13,14.
Myelodysplastic syndromes are a group of pre-leukemic disorders that arise from mutations in hematopoietic stem cells. MDS is frequently associated with a block in HSC differentiation and the production of dysplastic cells, which can often lead to bone marrow failure. MDS is the most commonly diagnosed myeloid neoplasm in the United States and is associated with a 3-year survival rate of 35%-45%15. MDS is often associated with a high risk of transformation to acute myeloid leukemia. This can be a fatal complication, as MDS-derived AML is resistant to most therapies and likely to relapse. AML that arises de novo due to translocations or mutations in hematopoietic stem and progenitors is also often resistant to standard chemotherapy16,17. Since MDS and AML are primarily diseases of the elderly, with the majority diagnosed over the age of 60 years, most patients are ineligible for curative bone marrow transplants. There is, thus, a significant need to identify novel regulators of disease progression. Since the bone marrow microenvironment can provide support for malignant cells14, defining changes in the bone marrow niche with disease progression may lead to the identification of novel therapeutics aimed at inhibiting tumor niche remodeling. There is, therefore, a significant need to identify novel regulators of disease progression. To this end, it is critical to identify and characterize changes in the bone marrow stromal cell populations that may provide support for the malignant cells.
Several murine models of AML and MDS have been generated and can be used to study changes in the bone marrow microenvironment during disease initiation and progression6,1,19,20,21,22. Here, protocols to identify changes in the bone marrow stromal cell populations using murine models of retrovirally induced AML6,20, as well as the commercially available Nup98-HoxD13 (NHD13) model of high-risk MDS to AML transformation19, are described. Mice transplanted with de novo AML cells succumb to the disease in 20-30 days6. The NHD13 mice develop cytopenias and bone marrow dysplasia around 15-20 weeks, which eventually transforms into AML, and nearly 75% of the mice succumb to the disease around 32 weeks. To analyze the murine model bone marrow microenvironment populations, bones are harvested, bone marrow and bone spicules are digested using enzymatic digestion, and the cells are then enriched for CD45-/Ter119- non-hematopoietic populations by magnetic sorting. While similar analyses have been previously described11,13,22,23,24,25, they often focus on either the bone marrow or the bone and do not incorporate cells from both sources in their analyses. The combined characterization of these populations, in conjunction with gene expression analyses, can provide a comprehensive understanding of how the cellular hematopoietic microenvironment provides support for disease initiation and progression (Figure 1). While the protocol described below focuses on retrovirally induced AML model and a genetic MDS model, these strategies can be easily adapted to study changes in the bone marrow niche of any murine model of interest.

Autor em destaque: Analisando o microambiente da medula óssea em malignidades hematológicas murinas 

Identificação de Populações Microambientais de Medula Óssea na Síndrome Mielodisplásica e Leucemia Mielóide Aguda

Our research aims to explore how the bone marrow's changing environment influences tumor growth. We developed a flow cytometry protocol to analyze the non-immune cells in bone marrow and bone tissues, focusing on murine hematological malignancies. This method is adaptable for studying bone marrow in various murine models.Our study focuses on isolating and identifying alterations in bone marrow stromal populations during cancer progression. Understanding their impact on disease onset and advancement could pave the way for new treatments that target these cancer-facilitating changes in the bone marrow stromal cells. Our protocol uniquely combines mechanical and enzymatic digestions, magnetic depletions, and flow cytometry to delineate the bone marrow microenvironment cellular makeup.It stands out by employing magnetic separation and incorporating cells from both bone and marrow, offering a more comprehensive representation of this microenvironment.

Este artigo descreve um método baseado em citometria de fluxo para análise de populações microambientais da medula óssea, como células do estroma endotelial e mesenquimal, a partir de modelos murinos de SMD e leucemia (Figura 1). A Figura 2 ilustra a estratégia de gating para detecção das populações de interesse, iniciando-se com a seleção de células (P1) na fração digerida e CD45/Ter119 depletada através do perfil de dispersão anterior e later...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Bone Marrow Microenvironment in Murine Hematological Malignancies at JoVE.com

Este é apresentado um protocolo detalhado para isolar e caracterizar populações microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndromes mielodisplásicas e leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica alterações no nicho da medula óssea não hematopoiética, incluindo as células endoteliais e estromais mesenquimais, com a progressão da doença.

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and ...

Nossa pesquisa visa explorar como o ambiente em mudança da medula óssea influencia o crescimento do tumor. Desenvolvemos um protocolo de citometria de fluxo para analisar as células não imunes da medula óssea e dos tecidos ósseos, com foco nas neoplasias hematológicas murinas. Este método é adaptável para o estudo da medula óssea em vários modelos murinos.Nosso estudo se concentra em isolar e identificar alterações nas populações estromais da medula óssea durante a progressão do câncer. Compreender seu impacto no início e no avanço da doença pode abrir caminho para novos tratamentos que visam essas mudanças facilitadoras do câncer nas células estromais da medula óssea. Nosso protocolo combina exclusivamente digestãos mecânicas e enzimáticas, depleções magnéticas e citometria de fluxo para delinear a composição celular do microambiente da medula óssea.Destaca-se por empregar a separação magnética e incorporar células do osso e da medula, oferecendo uma representação mais abrangente desse microambiente.

identifying-bone-marrow-microenvironmental-populations

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identifying Bone Marrow Microenvironmental Populations in Myelodysplastic Syndrome and Acute Myeloid Leukemia

797 visualizações.  University of Rochester Medical Center. Nossa pesquisa visa explorar como o ambiente em mudança da medula óssea influencia o crescimento do tumor. Desenvolvemos um protocolo de citometria de fluxo para analisar as células não imunes da medula óssea e dos tecidos ósseos, com foco nas neoplasias hematológicas murinas. Este método é adaptável para o estudo da medula óssea em vários modelos murinos.Nosso estudo se concentra em isolar e identificar alterações nas populações estromais da medula óssea durante a pro...

Vídeo: Autor em destaque: Analisando o microambiente da medula óssea em malignidades hematológicas murinas 

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and fibroblasts, which provide support for hematopoietic stem cells (HSCs). In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment also plays a role in the development of hematopoietic stem cell disorders, such as myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myeloid leukemia (AML). MDS-associated mutations in HSCs lead to a block in differentiation and progressive bone marrow failure, especially in the elderly. MDS can often progress to therapy-resistant AML, a disease characterized by a rapid accumulation of immature myeloid blasts. The bone marrow microenvironment is known to be altered in patients with these myeloid neoplasms. Here, a comprehensive protocol to isolate and phenotypically characterize bone marrow microenvironmental cells from murine models of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia is described. Isolating and characterizing changes in the bone marrow niche populations can help determine their role in disease initiation and progression and may lead to the development of novel therapeutics targeting cancer-promoting alterations in the bone marrow stromal populations.

Here a detailed protocol to isolate and characterize bone marrow microenvironmental populations from murine models of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia is presented. This technique identifies changes in the non-hematopoietic bone marrow niche, including the endothelial and mesenchymal stromal cells, with disease progression.

Pesquisa do câncer

Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment 

To begin, remove the tissue from the bones of the euthanized dissected mouse. Place the cleaned bones into a new six-well plate containing FACS buffer placed on ice. Transfer the bones into a mortar with two to five milliliters of FACS buffer.Grind the bones in a circular motion until the bone marrow is released. With a three milliliter syringe, pull up and flush down the bone marrow to homogenize it. Pull the homogenate into another syringe, then filter it through a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter tube.Rinse the tissue chunks from their filter back into the mortar with FACS buffer before homogenizing a second time. Filter the rinsed tissue as before. Next, rinse the remaining bone spicules back into the mortar with FACS buffer.Then flush the pieces into a 15 milliliter tube to ensure maximum yield. To digest the bone marrow, first centrifuge it at 300 G for five minutes at four degrees Celsius. Resuspend the bone marrow pellet in two milliliters of digestion mixture.Transfer the mixture to a 15 milliliter tube. Then incubate it at 37 degrees Celsius for 45 minutes on a rotator. Now, add 10 milliliters of FACS buffer to stop the enzymatic digestion.Filter the mixture through a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter tube. Centrifuge the suspension at 400 G for seven minutes at four degrees Celsius. Resuspend the pellet in one milliliter of RBC lysis buffer.Next, add 10 milliliters of FACS buffer to halt the lysis. Then filter the mixture as before into a 50 milliliter tube. Lastly, centrifuge the mixture at 300 G for five minutes at four degrees celsius.After discarding the supernatant, resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. For the digestion of bone spicules, first, vortex the bone spicules. Decant the supernatant and retain the bones at the bottom.Next, resuspend the spicules in one milliliter of the bone spicule digestion mixture. Incubate the tube on a rotator for 60 minutes at 37 degrees Celsius. Finally, stop the digestion with 10 milliliters of FACS buffer.Filter the mixture into the 50 milliliter tube containing RBC lysed and digested bone marrow.

Coleta e isolamento de medula óssea murina para caracterização do microambiente da leucemia mielóide 

Murine Bone Marrow Staining for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

To begin, mix the isolated murine bone marrow suspension with the bone spicule suspension. Pipette 10 microliters of the cell suspension onto a hemocytometer for counting. Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius.Then resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the cells with antibodies for magnetic depletion, add FC block, CD45 APC, and TER-119 APC. Then wash the cell suspension with FACS buffer.After centrifuging the remaining mixture, resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the cell suspension with microbeads for magnetic depletion, add mouse IgG and anti-APC microbeads. Incubate the mixture on ice for 20 minutes.Wash the LD column with two milliliters of MACS buffer. Resuspend the cells in the buffer, then filter it through a five milliliter test tube with a 35 micrometer cell strainer cap. Next, set the LD column on the magnetic separator stand and place a five milliliter test tube under the column to collect the eluted material.Pipette the cell suspension into the LD column and collect the negative fraction flow through in the test tube. Wash the column two times with one milliliter of MACS buffer and collect the eluent material in the same tube. Place the LD column over a new five milliliter test tube.With a pipette, dispense three milliliters of buffer into the column, then flush out the positively labeled cells into a five milliliter test tube. Centrifuge both the positive and negative fractions, then resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the CD45 TER-119 negative fraction add one microliter of each antibody for every 10 to the sixth cells.Place the suspension on ice for 20 minutes. Then wash the suspension with two milliliters of FACS buffer before centrifuging. Add one milliliter of the buffer to the pellet and pipette propidium iodide for live cell staining.Finally, filter the sample through a 35 micrometer cell strainer into a five milliliter test tube before analyzing the cells on a multicolor flow cytometer. Arteriolar endothelial cells significantly expanded in the acute myeloid leukemia microenvironment with a concomitant loss in the sinusoidal endothelial populations. A small expansion in the mesenchymal stromal cells were seen at eight weeks of age.