Para começar, misture a suspensão isolada de medula óssea murina com a suspensão de espícula óssea. Pipetar 10 microlitros da suspensão celular em um hemocitômetro para contagem. Centrifugar a suspensão celular a 300 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão FACS. Para corar as células com anticorpos para depleção magnética, adicionar bloqueio FC, CD45 APC e TER-119 APC. Em seguida, lave a suspensão celular com tampão FACS.
Após centrifugar a mistura restante, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão FACS. Para manchar a suspensão celular com microesferas para depleção magnética, adicione microesferas IgG de camundongo e anti-APC. Incubar a mistura no gelo por 20 minutos.
Lave a coluna LD com dois mililitros de tampão MACS. Ressuspenda as células no tampão e, em seguida, filtre-as através de um tubo de ensaio de cinco mililitros com uma tampa de filtro de células de 35 micrômetros. Em seguida, coloque a coluna LD no suporte do separador magnético e coloque um tubo de ensaio de cinco mililitros sob a coluna para coletar o material eluído.
Pipetar a suspensão da célula para a coluna LD e recolher o fluxo da fracção negativa através do tubo de ensaio. Lave a coluna duas vezes com um mililitro de tampão MACS e colete o material eluente no mesmo tubo. Coloque a coluna LD sobre um novo tubo de ensaio de cinco mililitros.
Com uma pipeta, distribua três mililitros de tampão na coluna e, em seguida, despeje as células marcadas positivamente em um tubo de ensaio de cinco mililitros. Centrifugar as frações positiva e negativa e, em seguida, ressuspender o pellet em 100 microlitros de tampão FACS. Para corar a fração CD45 TER-119 negativa adicione um microlitro de cada anticorpo para cada 10 até a sexta célula.
Coloque a suspensão no gelo por 20 minutos. Em seguida, lave a suspensão com dois mililitros de tampão FACS antes de centrifugir. Adicione um mililitro do tampão ao pellet e pipeta de iodeto de propídio para coloração de células vivas.
Finalmente, filtre a amostra através de um filtro de células de 35 micrômetros em um tubo de ensaio de cinco mililitros antes de analisar as células em um citômetro de fluxo multicolorido. As células endoteliais arteriolares expandiram-se significativamente no microambiente da leucemia mieloide aguda com perda concomitante nas populações endoteliais sinusoidais. Uma pequena expansão nas células estromais mesenquimais foi observada com oito semanas de idade.
