Hepatocellular Carcinoma Tissue Dissociation for Organoid Culture

Para iniciar a dissociação tecidual, colete de um a dois centímetros cúbicos de carcinoma hepatocelular ou tecido HTC de pacientes não tratados. Em seguida, coloque o tecido na solução de preservação do tecido e mantenha-o a quatro graus Celsius até o processamento. Agora, pré-aqueça as placas de cultura de células de superfície de fixação ultrabaixa por uma hora em uma incubadora definida a 37 graus Celsius.

Descongele o extrato da membrana basal durante a noite a quatro graus Celsius. Usando tesoura cirúrgica, corte o tecido tumoral em pequenos pedaços em uma placa de Petri dentro de uma capela de fluxo laminar. Transfira essas peças para um tubo cônico de 15 mililitros e adicione de cinco a 10 mililitros de meio basal.

Com uma pipeta barotrópica, lave o máximo de sangue possível. Deixe a mistura descansar por um a dois minutos antes de remover parte do sobrenadante, incluindo quaisquer células sanguíneas e coágulos de gordura flutuantes. Em seguida, centrifugar a mistura a 300 G por cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, extraia cuidadosamente o sobrenadante e adicione cinco mililitros de solução de digestão pré-aquecida ao tecido aparado. Coloque o tubo a 37 graus Celsius em um rotor para uma digestão ideal. Após 30 minutos da digestão inicial, use um microscópio para procurar pequenos aglomerados de células.

Para interromper a digestão, adicione cinco mililitros de meio basal frio ao tubo. Em seguida, use um filtro de célula de 100 micrômetros para peneirar em um novo tubo de 50 mililitros. Encha o tubo com meio basal frio para atingir um volume total de 50 mililitros.

Em seguida, centrifugar as células a dois G por 10 minutos a oito graus Celsius. Depois de concluído, remova cuidadosamente o líquido sobrenadante. Ressuspender o pellet em 50 mililitros de meio basal frio para obter o pellet celular para plaqueamento organoide.