Para começar, use fórceps para remover qualquer gordura e tecido conjuntivo da glândula salivar submandibular dissecada de um camundongo eutanasiado. Em seguida, coloque a glândula em um tubo de coleta com solução gelada de HBSS. Em seguida, use pinças para cortar a glândula em pedaços quadrados de um centímetro.
Aqueça 4% agarose a 50 graus Celsius e despeje a solução em um prato de 35 milímetros. Despeje uma pequena quantidade da solução de agarose em um prato separado e adicione os pedaços da glândula nele. Em seguida, gire os pedaços no excesso de agarose para cobri-lo.
Em seguida, coloque de quatro a seis pedaços da glândula no primeiro prato com agarose. Coloque a tampa no prato e transfira para uma caixa de gelo, cobrindo o prato com gelo para esfriar e assentar. Para seccionar os pedaços da glândula, primeiro, use um bisturi para cortar cuidadosamente ao redor do bloco de agarose embutido na glândula.
Em seguida, aplique uma gota de super cola no bloco de agarose e prenda-o ao estágio de um vibratome. Agora encha a câmara vibratória com PBS gelado contendo 1% de estreptomicina de penicilina. Com um bisturi, apague qualquer excesso de agarose e crie intervalos de cinco milímetros entre cada pedaço de glândula.
Alinhe a lâmina vibratória com o bloco de agarose e defina os pontos inicial e final das seções. Corte o bloco de tecido em cortes de 150 micrômetros de espessura em baixa velocidade e alta vibração. Depois de cortadas as seções, use um pincel para pegar as fatias e coloque-as em um prato com mídia RPMI pré-aquecida contendo os antibióticos.
Para cultivar os cortes submandibulares, primeiro, adicione 1,5 mililitros de meio RPMI aos poços de uma placa de seis poços. Coloque filtros de 0,4 micrômetro nos poços. Em seguida, com a ajuda de um pincel, transfira cuidadosamente de uma a seis fatias para cada filtro.
Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono. Após irradiar algumas placas experimentais com radiação gama para induzir lesão, devolva as placas à incubadora. Em seguida, encha os poços de uma placa de 24 poços com 500 microlitros de meio de cultura.
Com um pincel, levante as fatias do filtro e submerja-as suavemente nos poços. Incubar as fatias nas manchas nucleares relevantes. Em seguida, incube as fatias com anticorpos por duas horas a 37 graus Celsius sob agitação suave.
Submergir as fatias em meios de cultura três vezes para lavá-las. Deixe as fatias incubar em cada solução de lavagem durante 10 minutos à temperatura ambiente sob agitação suave. Em seguida, use pinças para remover a fita de um espaçador de imagem de dupla face.
Coloque o espaçador no fundo de uma placa de seis poços com fundo de vidro e, em seguida, pipete 50 microlitros de mídia para o espaço no centro do espaçador. Coloque a fatia na mídia garantindo que ela fique plana. Em seguida, com uma pipeta, remova cuidadosamente 20 microlitros da mídia do vão.
Use pinças para remover cuidadosamente a fita do lado superior do espaçador e coloque uma tampa circular de 25 milímetros sobre ele. Pressione ao redor das bordas do espaçador para garantir a fixação firme da tampa. Imagem do corte em um microscópio confocal.
Cortes não irradiados da glândula submandibular cultivados por sete dias mantiveram seu sinal de MT e arquitetura epitelial. Entretanto, aos três dias pós-irradiação, observou-se atrofia das células acinares e ductais. Células positivas para caspase foram observadas quatro dias após a irradiação.
H2AX gama elevado foi observado em cortes irradiados, indicativos de danos in vivo ao DNA. Imagens em tempo real de macrófagos confirmaram a fagocitose das células epiteliais no modelo de cultura de corte. Células individuais podem ser detectadas e segmentadas para posterior análise do comportamento celular, como migração.
