Preparação de células alimentadoras iMEF e transdução de reprogramação para células-tronco pluripotentes induzidas

1 Para começar, cubra a placa de 6poços 2 com dois mililitros de solução de gelatina a 0,2% por poço. 3 Incube a placa a 37 graus Celsius 4 e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. 5 Em seguida, adicione iMEFs gota a gota em um tubo de 15 mililitros 6 contendo 10 mililitros 7 de meio de fibroblastos humanos pré-aquecido, 8 e misture invertendo suavemente o tubo.

9 Centrifugar a suspensão celular a 309 G durante três minutos. 10 E remova o sobrenadante antes de ressuspender o pellet 11 em 12 mililitros de meio de fibroblastos humanos. 12 Coloque dois mililitros da suspensão celular 13 em cada poço da placa de seis poços revestida de gelatina.

14 E incubar durante a noite a 37 graus Celsius 15 e 5% de dióxido de carbono. 16 Descarte o meio do 17 infectado com lentivírus e PDAC não infectado e lave as células duas vezes com PBS. 18 Em seguida, adicione 500 microlitros de tripsina para dissociar as células.

19 E incube a 37 graus Celsius 20 com 5% de dióxido de carbono e 5% de oxigênio 21 por 15 minutos. 22 Centrifugar a suspensão da célula a 300 g durante cinco minutos. 23 E ressuspenda o pellet em um mililitro de meio PDAC.

24 Lave a placa iMEF com meio PDAC. 25 Em seguida, adicione 50.000 células PDAC infectadas com lentivírus 26 por poço em cinco poços de placa iMEF e incube durante a noite 27, conforme demonstrado anteriormente. 28 Depois de preparar o meio de reprogramação, 29 adicionar 100 microlitros de fibroblastos básicos fator de crescimento 30 a 100 mililitros de meio de reprogramação.

31 No dia seguinte, lave as células que crescem em alimentadores iMEF duas vezes 32 com meios de reprogramação pré-aquecidos. 33 Em seguida, adicione dois mililitros de meio a cada poço, 34 e incube durante a noite a 37 graus Celsius 35 com 5% de dióxido de carbono e 3% de oxigênio. 36 Depois de passar pelo pool de IPSC cinco vezes, 37 observam as colônias robustas 38 mantendo a morfologia semelhante ao ESC.

39 O PDAC, BxPc3, 40 H6c7 e fibroblasto humano 41 mostraram diferentes dias de reprogramação 42 para formar uma morfologia madura semelhante ao ESC. Foram estabelecidas 43 linhagens clonais de IPSC, 44 a partir de cada reprogramação de PDAC, 45 células de BxPc3, H6c7, 46 e fibroblastos humanos. 47 Todas as linhas IPSC estabelecidas coraram positivamente 48 para TRA-160, confirmando sua reprogramação para pluripotência.