Para começar, isole o átrio esquerdo e as veias pulmonares ou PVs do coração do rato. Coloque o tecido isolado em um criomolde com a base do coração e o ápice do pulmão voltados para cima. Destorça e desembarace os PVs caso eles estejam complicados.
Em seguida, preencha o criomold com o composto OCT. Usando pinças finas, aplique uma compressão suave sobre os PVs sem movê-los para remover o ar residual. Congelar o tecido no composto OCT em gelo seco.
Para imunomarcação, descongelar as lâminas PV congeladas do mouse em um sistema de coloração por 20 minutos. Em seguida, administrar várias gotas de uma solução fixadora de paraformaldeído a 4% nas seções para fixar o tecido à lâmina. Após a incubação, mova as lâminas para um rack vertical e submerja-as em um recipiente cheio de PBS.
Coloque o recipiente em um agitador lento por cinco minutos para enxaguar as lâminas. Usando uma caneta bloqueadora de líquidos contendo xilol, circunde cada seção em cada slide. E reorganizar as lâminas no sistema de coloração.
Usando uma pipeta de Pasteur, aplique uma ou duas gotas de solução de permeabilização em cada amostra. Em seguida, limpe a solução Triton X-100 lavando as lâminas por cinco minutos em PBS. Depois de reorganizar as lâminas no sistema de coloração, adicione uma ou duas gotas do buffer de bloqueio a cada seção, garantindo uma cobertura completa.
Em seguida, prepare um mililitro da mistura primária de anticorpos que consiste nos anticorpos primários e no tampão de bloqueio. Descarte o buffer de bloqueio restante do slide. Administrar duas ou três gotas da mistura primária de anticorpos a cada secção.
Após a incubação, coloque as lâminas em um rack vertical e enxágue as lâminas por cinco minutos em tampão de lavagem, mantendo uma agitação suave. Em seguida, prepare um mililitro da mistura de anticorpos secundários que consiste nos anticorpos secundários e tampão de lavagem. Reposicione as lâminas no sistema de coloração e use uma pipeta para dispensar duas ou três gotas da mistura de anticorpos secundários em cada seção.
Em seguida, limpe as lâminas três vezes por cinco minutos cada em tampão de lavagem enquanto agita. Em seguida, adicione duas ou três gotas da solução Hoechst 33342 a cada seção disposta no sistema de coloração. Coloque as lâminas em uma cremalheira vertical e enxágue-as por cinco minutos em tampão de lavagem com agitação suave.
Adicione uma ou duas gotas de meio de montagem fluorescente a cada lâmina e sele as lâminas com lamínulas. A região do orifício das veias pulmonares no átrio esquerdo e junção das veias pulmonares, veias extrapulmonares e veias interpulmonares foram observadas sob aumento de 10X. Sinais específicos de cTnT com estriação muscular típica no orifício das veias pulmonares, veias extrapulmonares e veias intrapulmonares foram observados em aumento de 40X.
A Cx43 foi encontrada nas três regiões pulmonares e foi projetada primariamente entre cardiomiócitos vizinhos. Sinais relacionados à Cx43 foram observados no lado polar e na face lateral dos cardiomiócitos nas mangas miocárdicas.
