Para começar, semeie células DAKIKI em uma placa de seis poços a uma densidade de seis milhões de células por poço. Montar os diferentes grupos experimentais e, após o tratamento correspondente, com base no método de agrupamento, incubar as placas por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Extraia o RNA total das células DAKIKI, seguindo as instruções do kit de extração de RNA total.
Pegue um microlitro do RNA extraído de cada grupo de amostras para medir sua concentração. Transcreva reversamente um micrograma de RNA total de cada amostra em DNA complementar, seguindo as instruções do kit. Realize a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa ou amplificação por RT-PCR para detectar a expressão de cada gene.
Para western blotting após a incubação inicial de 24 horas, colete as células de cada grupo. Adicione um volume apropriado de solução de lise celular às células coletadas antes de incubá-las no gelo por 30 minutos. Centrifugue as amostras a 13.500g por 10 minutos a quatro graus Celsius e colete o sobrenadante para análise posterior.
Vortex as amostras de proteína com 5X SDS-PAGE Loading Buffer na proporção de quatro para um e aqueça as amostras mistas a 100 graus Celsius por cinco minutos para desnaturar a proteína antes da eletroforese. Quando a execução estiver concluída, transfira o gel para as membranas de PVDF. Para bloquear a membrana, incube-a em 5% de leite desnatado por duas horas em temperatura ambiente.
Em seguida, incube a membrana com os anticorpos primários correspondentes por 24 horas enquanto usa o anticorpo beta-actina como controle interno. Em seguida, incubar as membranas com o anticorpo secundário anti-IgG de cabra correspondente à temperatura ambiente durante duas horas. Finalmente, trate as membranas com uma quantidade adequada de solução de trabalho de quimioluminescência aprimorada para detecção de banda de proteína.
Os resultados quantitativos de RT-PCR mostraram que a expressão relativa de mRNA de C1GalT1 e Cosmc foi regulada negativamente em células DAKIKI no grupo modelo, em comparação com o grupo controle. A dioscina regulou positivamente o mRNA relativo de ambos os dois graus diferentes em comparação com o grupo modelo. Os resultados do Western blotting também mostraram que, em comparação com o grupo controle, a expressão proteica de C1GalT1 e Cosmc em células DAKIKI no grupo modelo diminuiu.
As expressões proteicas foram reguladas positivamente após a intervenção da dioscina.
