Para começar, descongele o frasco de crio do PBMC em banho-maria a 37 graus Celsius por dois a três minutos, invertendo-o suavemente. Em seguida, transfira as células descongeladas para um tubo cônico de 50 mililitros. Enxaguar o frasco para injetáveis de crio com um mililitro de meio de crescimento completo quente e adicionar a solução gota a gota às células no tubo cónico para realizar o primeiro passo de diluição.
Agora centrifugar a suspensão celular por cinco minutos e inclinar o tubo cônico fluentemente para remover o sobrenadante. Ressuspenda as células em três mililitros de meio de crescimento completo aquecido. Para a contagem de células, misture 10 microlitros de suspensão celular com azul de tripano.
Conte as células usando 10 microlitros de solução de células coradas, com um contador de células automatizado ou uma câmara celular. Use meio de crescimento completo quente para diluir as células para atingir uma concentração final de uma vez 10 a sexta células por mililitro. Em seguida, semeie 100 microlitros de suspensão celular em cada poço de uma placa de cultura celular de 96 poços.
Adicione 100 microlitros da diluição do fármaco em cada poço. Para colher as células, centrifugar a placa de cultura celular por 10 minutos. Use uma bomba de vácuo para remover o sobrenadante enquanto coloca a ponta da bomba no canto inferior do poço para reter as células.
Agora adicione 200 microlitros de PBS gelado a cada poço. Depois de centrifugar a placa por cinco minutos, retire o sobrenadante. Em seguida, adicione 15 microlitros de tampão de lise a cada poço.
Usando película de vedação adesiva, sele a placa para proteger contra contaminação. Vórtice a placa e centrifuga-a por um minuto. Finalmente, coletar seis microlitros da solução de células lisadas em uma placa de PCR.
