Para começar, colete as CMSP tratadas com medicamentos por centrifugação e colete o lisado celular em uma placa de PCR. Centrifugar a placa para recolher o lisado no fundo. Em seguida, realize a desnaturação do mRNA usando um termociclador.
Em seguida, adicione seis microlitros da mistura de reação de transcriptase reversa a cada poço para atingir um volume total de 12 microlitros. Sele a placa para proteger contra contaminação e evitar evaporação. Centrifugar a placa depois de vomitá-la brevemente.
Posicione a placa no termociclador e inicie o programa de reação de transcrição reversa. Após a transcrição reversa, centrifugar a placa de PCR, adicionar 15 microlitros da mistura de pré-amplificação em cada poço e selá-la. Coloque a placa selada no termociclador e inicie a reação de pré-amplificação.
Para limpar o cDNA, adicione esferas de purificação magnética a cada poço e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Posicione a placa de PCR em um rack magnético por cinco minutos ou até que as contas se separem. Depois disso, remova cuidadosamente o sobrenadante.
Enquanto mantém a placa no rack magnético, introduza suavemente 100 microlitros de etanol 80% recém-preparado para limpar as contas. Após uma incubação de 30 segundos, use uma pipeta para eliminar o sobrenadante. Deixe as contas secarem ao ar no rack magnético por cinco minutos ou até que o etanol evapore totalmente e as contas não pareçam mais brilhantes.
Após retirar a placa do rack magnético, ressuspenda as contas em 20 microlitros de água livre de nucleases. Reposicione a placa no rack magnético até que as contas estejam separadas. Transfira o eluído para uma nova placa de PCR preparada para controle de qualidade e marcação de cDNA.
Para a etiquetagem, adicione três microlitros da mistura de etiquetagem para cada reação em uma nova placa de PCR. Adicione um microlitro de cDNA a cada reação. Inicie a reação de marcação imediatamente.
Em seguida, neutralize a reação adicionando um microlitro de tampão de marcação neutralizado a cada reação. Para PCR de enriquecimento, adicione nove microlitros da mistura de PCR de enriquecimento em cada reação para atingir um volume total de 14 microlitros. Inicie o programa PCR de enriquecimento.
