Transfira uma pelota imune enriquecida com cérebro de camundongo de um tubo de 15 mililitros para uma placa redonda de fundo de 96 poços. Depois de centrifugar a placa a 500 G por cinco minutos, remova o sobrenadante mexendo. Ressuspenda as células em 100 microlitros de tampão FACS e, em seguida, transfira 10 microlitros de cada poço para os poços de controle.
Centrifugar a 500 G durante cinco minutos. Após a remoção do sobrenadante das células centrifugadas, adicionar 50 microlitros de bloco FC de dupla concentração. Incubar por 10 minutos no gelo.
Agora adicione 50 microlitros da mistura mestra de anticorpos com o dobro da concentração final desejada e incube-a no gelo no escuro. Em seguida, adicione 200 microlitros do tampão FACS a cada poço e centrifugue a 500 G por cinco minutos. Descarte o sobrenadante agitando e, em seguida, lave as células em 300 microlitros de tampão FACS.
Centrifugar e ressuspender as células em 200 microlitros de tampão FACS. Finalmente, transfira a suspensão para um tubo de classificação de fluxo contendo 300 microlitros de tampão FACS.
