Lave as células acima tratadas com PBS gelado para remover qualquer meio residual e adicione 50 microlitros do tampão de lise RIPA contendo PMSF para lisar as células. Colete as células em um tubo. Incubar as células no gelo por alguns minutos para garantir a lise completa, em seguida, centrifugar a quatro graus Celsius a 12.000 g por 15 minutos.
Em seguida, misture o lisado celular com um tampão de carga e aqueça a mistura a 95 a 100 graus Celsius por cinco a 10 minutos em banho-maria para desnaturar as proteínas. Coloque 10 microlitros de proteína total de cada amostra em um gel SDS0-PAGE. Passe o gel sob uma tensão constante de 80 volts.
Pare a eletroforese quando o azul de bromofenol atingir o fundo do gel de separação. Em seguida, use um sistema de transferência úmida em um banho de gelo para transferir as proteínas separadas do gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. Após a conclusão da transferência, remova a membrana e incube a membrana em um tampão de bloqueio à temperatura ambiente por cerca de uma hora.
Incubar a membrana com um anticorpo secundário conjugado à HRP. Visualize as bandas de proteínas na membrana usando um substrato quimioluminescente e capture o sinal usando um sistema de imagem por quimioluminescência. A análise de Western blot mostrou que a expressão suprimida de FAM83A aumentou as proteínas Bax e clivada-caspase-3, diminuiu a expressão de BCL-2 e aumentou a liberação de citocromo c.
