Para começar, pegue as seções cerebrais de parafina de seis camundongos C57 pretos injetados em PFF. Descere as lâminas mergulhando-as em substituto de xileno e incubando-as por dois minutos. Para reidratação, mergulhe as lâminas em 100%95% e 70% de etanol e, em seguida, duas vezes em água deionizada.
Transfira as amostras para um recipiente micro-ondulável juntamente com água destilada dupla. Aqueça o tampão citrato 100 vezes com pH seis a quatro graus Celsius. Em seguida, prepare 350 mililitros de tampão citrato fresco.
Despeje o tampão de citrato preparado em um recipiente plástico com tampa. Coloque as lâminas no recipiente tampão de citrato e prenda a tampa. Leve as amostras ao micro-ondas a 700 watts por quatro minutos e, em seguida, reserve um tempo para um descanso de cinco minutos.
Levar ao micro-ondas por mais 1,5 minutos, seguido de um período de repouso de cinco minutos e repor o tampão citrato. Leve ao micro-ondas por 1,5 minutos e deixe descansar por cinco minutos. Em seguida, resfriar as amostras e o tampão citrato no gelo por 20 minutos e lavá-las com água bidestilada.
Seque as lâminas da amostra usando um papel toalha sem tocar no tecido. Usando uma caneta de papanicolau, desenhe retângulos ao redor dos pedaços de tecido. Agora transfira todas as lâminas para uma caixa de coloração imune de lâminas.
Lave-os suavemente várias vezes com TBS-T, garantindo que as gotas TBS-T permaneçam dentro dos retângulos da caneta PAP. Toque nas lâminas em um papel toalha para remover TBS-T. Adicione 50 microlitros de bloqueio a cada retângulo e incube por uma hora à temperatura ambiente.
No final da incubação, usando um papel toalha, remova a solução de bloqueio das amostras. Pipetar suavemente 50 microlitros da mistura de anticorpos primários e TBS-T para cada retângulo e incubar as amostras durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as lâminas com TBS-T.
Remova o TBS-T tocando em um papel toalha. Repita esse processo três vezes. Em seguida, adicione 50 microlitros de mistura de anticorpos secundários em uma a 1000 diluições em TBS-T para cada retângulo e incube a 37 graus Celsius por uma hora no escuro.
Em seguida, lavar a amostra três vezes com TBS-T. Em seguida, incubar a amostra com DAPI na concentração de dois microgramas por mililitro em TBS-T por um minuto. Retire a solução DAPI batendo em um papel toalha e lave três vezes com TBS-T.
Para montar uma tampa de vidro, adicione duas gotas por lâmina de reagente de montagem às amostras. Pressione a tampa deslizando suavemente para eliminar bolhas e deixe as amostras secarem por uma hora à temperatura ambiente. Fotografe pelo menos 50 células em vários campos usando um sistema estruturado de imagem de fluorescência de iluminação equipado com uma objetiva de óleo de 60 vezes ou tecnologia confocal.
Para analisar as células, isole a região de interesse desenhando um contorno em torno da célula positiva ou negativa e usando a função de cultivo. Em seguida, ative os descritores de forma e limite as opções de limite na função de medição definida. Ajuste o nível de limite selecionando a função de limite no menu de ajuste.
Finalmente, use a ferramenta analisar partículas e defina um tamanho apropriado para capturar as mitocôndrias. Por exemplo, defina o tamanho para 25 infinitos, em seguida, ative unidades de pixel e selecione mostrar máscaras"Substancial nigra pars compacta de PFF injetado camundongos co-amino corados para tirosina hidroxilase VDAC1, PS129 alfa-sinucleína e DAPI são mostrados. A coloração anti-PS129 alfa-sinucleína permitiu discriminar as células que abrigavam lesões de PS129 das células saudáveis.
A análise de imagens da coloração VDAC1 de neurônios positivos para tirosina hidroxilase revelou uma redução tanto da contagem do número mitocondrial quanto da razão de aspecto entre os neurônios portadores de lesões PS129 e os neurônios que não as possuíam.
