Para começar, selecione uma placa de 24 poços contendo insertos com filtros de 0,4 mícron. Usando uma pipeta, adicione 500 microlitros de HBSS abaixo e acima das pastilhas do filtro. Em seguida, feche a placa de poço múltiplo e coloque-a em uma incubadora por duas horas.
Após a incubação, aspirar cuidadosamente o HBSS da placa. Prepare uma solução de colágeno livre de células em um tubo estéril de 50 mililitros em DMEM sobre gelo. Adicione 250 microlitros de colágeno acima do filtro de membrana e coloque a tampa sobre a placa.
Deixe a solução polimerizar à temperatura ambiente. Em seguida, remova a cultura de células de fibroblastos L-929 da incubadora. Adicionar dois mililitros de uma solução de EDTA de tripsina pré-aquecida ao balão e colocá-lo numa incubadora durante três a cinco minutos.
Transfira a suspensão celular para um tubo estéril de 15 mililitros e centrífuga a 645 G por cinco minutos. Usando uma bomba de vácuo, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em um mililitro de DMEM. Adicionar 20 microlitros de suspensão celular em um tubo contendo 20 microlitros de solução de Azul de Tripano.
E use uma câmara de contagem de células para avaliar a densidade celular. Em seguida, remova a cultura de células de monócitos U-937 da incubadora. Centrifugar a suspensão celular e ressuspender o pellet em um mililitro de RPMI.
Depois de garantir que as células sejam suspensas homogeneamente, conte-as usando uma câmara de contagem de células. Em seguida, prepare suspensões celulares contendo 50.000 células L-929 e 15.000 células U-937, respectivamente, em 50 microlitros de DMEM. Adicione cada suspensão celular de 50 microlitros a 450 microlitros de colágeno e misture bem.
Sobreponha a lâmina própria livre de células pré-codificada com 500 microlitros da solução de células de colágeno. Feche a placa e coloque-a em uma incubadora por duas horas para permitir que a solução se fixe. Em seguida, remova a cultura de células Caco-2 da incubadora.
Usando uma bomba de vácuo, aspirar o meio e enxaguar as células com 10 mililitros de PBS. Adicione cinco mililitros de solução de EDTA de tripsina PBS e coloque-a em uma incubadora por cinco a oito minutos. Em seguida, centrifugar a suspensão celular e ressuspender o pellet em um mililitro de DMEM.
Após a contagem, preparar uma suspensão celular contendo 150.000 células Caco-2 em 50 microlitros de DMEM. Coloque a placa em uma capela de fluxo laminar por 10 minutos antes de transferi-la para a incubadora. Após 30 minutos, adicionar 500 microlitros do DMEM acima do modelo reconstruído e 500 microlitros abaixo do filtro e retornar a placa à incubadora.
No dia seguinte, substitua cuidadosamente o meio por 500 microlitros de DMEM fresco acima e abaixo do filtro, respectivamente.
