Para a incorporação de células em parafina, ajuste a máquina de parafina para 58 graus Celsius. Usando um alicate, transfira as inserções de membrana para limpar poços de uma placa estéril de 24 poços. Adicione 500 microlitros de formalina e PBS 37% tamponada acima do filtro e um mililitro abaixo do filtro.
Feche a tampa e deixe a placa em um exaustor por duas horas. Uma vez que a lâmina própria é descolada da inserção da membrana, transferir a mucosa intestinal para um copo contendo 25 mililitros de etanol a 35% e incubar por 10 minutos. Após a desidratação em concentrações crescentes de etanol, colocar as amostras em 50 mililitros de xileno ou um agente de limpeza histológica por 10 a 20 minutos.
Uma vez que as amostras estejam transparentes, coloque-as em um suporte de de tecido metálico e submerja-as em parafina líquida dentro de uma máquina aquecida. Após 45 minutos, use um micrótomo para cortar seções de quatro mícrons. Coloque a seção de corte sobre as lâminas e seque-as em um forno a 37 graus Celsius por 24 horas.
Um modelo aceitável de mucosa equivalente intestinal 3-D consiste em células Caco-2 formadas em uma monocamada apertada e regular acima da lâmina própria rica em matriz extracelular. Modelos inaceitáveis incluem aqueles que apresentam crescimento excessivo, camadas epiteliais desorganizadas, malformação ou falta de formação da camada epitelial. O efeito pró-inflamatório da proteína do trigo com alto teor de glúten interrompeu a monocamada celular e reduziu a espessura da camada epitelial em comparação com o grupo controle.
O conteúdo de proteína oclustina foi significativamente maior no grupo controle do que no grupo exposto à proteína glúten. As colorações CD14 e CD11b dos monócitos U937 mostraram que a proteína do trigo com alto teor de glúten ativou os monócitos e induziu sua migração e diferenciação em macrófagos. Sob o desafio do lipopolissacarídeo, as células Caco-2 aumentaram a produção de muco e a liberação do marcador inflamatório midkine.
