Para começar, prepare o buffer 2X para RT-qPCR em água livre de DNase/RNase. Guarde o tampão a menos 20 graus Celsius até nova utilização. Em seguida, misture os primers e as sondas em um tubo de 1,5 mililitro.
Faça o volume com buffer de eluição. Em seguida, guarde o tubo a menos 20 graus Celsius. Prepare uma mistura enzimática com Taq polimerase e M-MLV RT em um tubo de 1,5 mililitro sobre gelo.
Completar o volume com tampão de armazenamento Taq polimerase. Agora ressuspenda os RNAs sintéticos virais em tubos separados com 100 microlitros de tampão Tris-EDTA para fazer estoques de 10 a sextas cópias de RNA por microlitro. Para misturar os estoques de vírus, adicione cinco microlitros cada de influenza A e B do SARS-CoV-2 a 50 microlitros de tampão Tris-EDTA.
Da mesma forma, misture SARS-CoV-2 e MERS-CoV para obter uma segunda mistura viral. Diluir dez vezes ambas as misturas para obter uma diluição final de 10 cópias de RNA por microlitro. Para cada poço de uma placa de 96 poços, pipeta tampão 2X, primer, enzima, água livre de DNase/RNase e as misturas de RNA correspondentes.
Sele a placa com um selo de placa adesiva. Em seguida, centrifugar a placa por um minuto para coletar o líquido no fundo do poço. Em seguida, programe a máquina de PCR para aceitar o tipo de bloco rápido de 96 poços com o tipo experimental definido para curva padrão.
Defina os reagentes como reagentes TaqMan e selecione as propriedades de execução padrão. Defina os alvos genéticos e o corante repórter. Em seguida, defina os nomes das amostras para cada reação a ser testada e atribua alvos e amostras ao layout da placa.
Agora, insira o programa do ciclo no instrumento. Transfira a placa para a máquina qPCR em tempo real na orientação correta e pressione run para iniciar o ciclo. Escolha o local do arquivo para salvar os dados experimentais.
Em seguida, examine os gráficos de amplificação fornecidos pelo programa qPCR. Os dois kits desenvolvidos foram capazes de amplificar com sucesso todos os três genes-alvo simultaneamente com tão baixas quanto 10 cópias de RNA por reação. As eficiências de amplificação para todas as titulações virais foram superiores a 99%
