Para começar, a cultura de células de Agrobacterium tumefaciens em placas de ágar de levedura manitol suplementadas com antibióticos seletivos. Incube as placas durante a noite a 28 graus Celsius em uma incubadora em pé. No dia seguinte, inocular colônias da cultura em 12,5 mililitros de mistura de caldo de levedura Mannitol Luria-Bertani e incubar em um agitador orbital a 28 graus Celsius por 16 horas a 250 RPM.
Inocular 12,5 mililitros da cepa Agrobacterium LBA4404 em 112,5 mililitros de caldo de Levedura Manitol com antibióticos. Incubar a cultura em um agitador orbital a 28 graus Celsius por 16 horas a 250 RPM. Ajustar a cultura noturna para uma densidade óptica de 0,4 com o caldo de cultura.
Em seguida, adicione 20 micromolares de acetoseringona antes da incubação. Uma vez que a cultura incubada atinja uma densidade óptica de um, centrifugar para pellet as células. Ressuspender o pellet em solução de suspensão até uma densidade óptica de 0,6 e adicionar 200 acetosiringonas micromolares antes da incubação.
Para a agroinfiltração, colher plantas lenhosas de cacau que tenham galhos com folhas. Adicionar ácido jasmônico 250 micromolares à suspensão de Agrobacterium. Em seguida, configure um exsicador com um medidor de vácuo como uma câmara de vácuo para medir a pressão interna.
Coloque um anel de salto para permitir a passagem do galho da planta. Coloque o copo com cultura de Agrobacterium dentro do dessecador, e coloque o galho entre o exsicador e sua tampa, com as folhas desejadas submersas na cultura de Agrobacterium. Em seguida, use material de impressão de silicone para selar as lacunas entre o anel de salto, o ramo da planta e o dessecador.
Uma vez que o material de silicone tenha polimerizado, feche o dessecador, não deixando lacunas, e conecte-o à bomba de vácuo. Ligue a bomba de vácuo até atingir menos 0,07 megapascals. Quando a pressão desejada for atingida, feche a válvula de pressão e desligue a bomba para manter a pressão por cinco minutos.
Abra a válvula de pressão de forma gradual e constante para restaurar a pressão da câmara. Depois de repetir a infiltração mais duas vezes, retire o ramo da suspensão celular. Limpe as folhas infiltradas com água destilada e, em seguida, coloque as plantas a 25 graus Celsius no escuro por 48 horas.
Após a incubação, expor o tecido infiltrado a um período de fotos claras de 16 horas e oito horas de escuro. As folhas infiltradas das plantas aparecem mais escuras em certas partes, indicando a penetração de Agrobacterium. O sistema repórter usado produziu acúmulo de betalaína nas folhas, que pode ser facilmente observada como pigmentação vermelha brilhante a olho nu.
Observou-se que o acúmulo de betalaína varia com a viabilidade tecidual.
