Para começar, descongele as amostras de plasma sanguíneo isoladas a 37 graus Celsius. Transfira 100 microlitros de cada amostra de plasma para tubos de 1,5 mililitros. Adicione um mililitro de tampão HBSA isento de cálcio a cada tubo.
Centrifugar as amostras a 20 000 g durante 15 minutos a quatro graus Celsius. Aspirar o sobrenadante a 20 microlitros sem perturbar o pellet. Em seguida, adicione um mililitro do tampão HBSA sem cálcio a cada tubo.
Em seguida, pipetar para cima e para baixo para reconstituir o pellet. Vórtice cada tubo por alguns segundos para garantir a distribuição igual das vesículas extracelulares. Em seguida, centrifugar a 20.000 g por 15 minutos a quatro graus Celsius.
Novamente, aspirar o sobrenadante para 20 microlitros sem perturbar o pellet. Em seguida, reconstitua o pellet em 80 microlitros de tampão HBSA isento de cálcio. Pipetar a suspensão para cima e para baixo para obter uma suspensão uniforme.
Para medir a atividade do fator tecidual da vesícula extracelular, primeiramente, pipetar 40 microlitros da amostra da vesícula extracelular em dois poços de uma placa de 96 poços. No primeiro poço, adicione 11 microlitros de um inibidor de camundongo anti-humano TF IgG. Ao outro poço, adicione 11 microlitros de IgG de camundongo controle.
Após a incubação, adicione 50 microlitros da solução de mistura de fator em cada poço. Cubra a placa com filme e, em seguida, incube a placa por duas horas a 37 graus Celsius. Adicione 25 microlitros de tampão HBSA EDTA para interromper a geração do fator Xa.
Reconstituir o substrato cromogênico em água destilada para uma concentração de quatro milimoles. Agora adicione 25 microlitros do substrato cromogênico em cada poço. Cubra a placa com filme e depois envolva-a em papel alumínio.
Incubar a placa a 37 graus Celsius durante 15 minutos. Em seguida, centrifugar a placa a 1.500 g por um minuto para remover quaisquer bolhas. Em seguida, coloque a placa em um leitor de placas a 405 nanômetros.
Utilizar a curva padrão gerada com o fator tecidual recombinante relipidado para converter a geração do fator Xa de cada poço. Em seguida, calcule a geração do fator Xa dependente do fator tecidual. Seis dos 11 doadores responderam ao lipopolissacarídeo médio a alto, enquanto cinco dos 11 doadores responderam ao lipopolissacarídeo baixo.
