Para começar, tome um tubo com organoides derivados do paciente ou suspensão de DOP em uma quantidade igual de extratos de membrana basal, ou BME. Usando uma pipeta de 20 microlitros, semeie cinco cúpulas de microlitros no centro de cada poço de uma placa pré-aquecida de 96 poços. Depois de semear todos os poços, coloque a tampa sobre a placa e inverta-a suavemente.
Incubar a placa invertida a 37 graus Celsius por 20 minutos na incubadora de cultura de tecidos para permitir que as cúpulas se solidifiquem. Vire a placa para que a tampa fique virada para cima. Em seguida, incube novamente.
Após a adição de corantes fluorescentes e fármacos às placas contendo as DOPs. Coloque a placa na citação cinco. Inicie o software Gen5 e, na janela do gerenciador de tarefas, selecione o modo manual do imageador e clique em capturar agora.
Nas configurações, especifique o objetivo, o filtro, o formato da microplaca e o tipo de embarcação, selecione usar tampa e use a velocidade mais lenta da transportadora e clique em OK. Em seguida, escolha um poço de interesse. Selecione o canal de campo brilhante, clique em auto expose e ajuste as configurações conforme necessário.
Ao lado de configurar a pilha Z, expanda a guia do modo de imagem, selecione a pilha Z e ajuste o foco usando as setas de ajuste do curso até que todos os PDOs estejam fora de foco. Estabeleça esse ponto como a parte inferior da pilha Z e repita no sentido inverso para definir a parte superior. Depois, configure os canais fluorescentes abrindo a etapa de edição de imagem.
Em canais, selecione o número desejado de canais, designe um canal para o campo brilhante e canais adicionais para cada canal fluorescente. Feche a janela clicando em ok, altere o menu suspenso para GFP para definir a exposição para o primeiro canal fluorescente, clique em exposição automática e ajuste as configurações de exposição na guia de exposição para reduzir o sinal de fundo. Para copiar as configurações de exposição para a guia modo de imagem, clique no ícone de cópia e, em seguida, clique em editar etapa de criação de imagens para abrir uma nova janela.
No canal GFP, clique no ícone da área de transferência na linha de exposição para adicionar configurações de iluminação, tempo de integração e ganho de câmera ao canal. Agora clique no ícone da câmera e escolha o pré-processamento da imagem na etapa de adição de processamento. Na guia campo brilhante, desmarque a opção aplicar pré-processamento de imagem.
Para cada guia de canal fluorescente, verifique se a opção aplicar pré-processamento de imagem está marcada. Desmarque, use as mesmas opções do canal um e clique em OK para fechar a janela. Agora clique na projeção Z na etapa de processamento de adição, ajuste o intervalo de fatias, se necessário, e feche a janela clicando em ok.
Para configurar o protocolo para imagens cinéticas, na barra de ferramentas, clique em conjunto de imagens e, no menu suspenso, escolha criar experimento a partir deste conjunto de imagens. Clique nas opções sob o outro título e marque a caixa de procedimento cinético descontínuo. Abaixo do tempo total estimado, insira o tempo de execução para o experimento.
Feche a janela clicando em OK. Além disso, defina o layout da placa e o gradiente de temperatura neste momento. Valide as etapas de redução de dados clicando nas janelas.
Em seguida, navegue até o arquivo e clique em salvar protocolo como na barra de ferramentas. Selecione um local de salvamento. Digite um nome de arquivo e clique em salvar.
Para iniciar a imagem cinética, carregue o protocolo no software de agendamento bio spa on demand e escolha um slot disponível. Na guia Informações do procedimento, selecione usuário no menu. Ao lado do slot de protocolo, clique em selecionar e escolha adicionar uma nova entrada.
Agora clique em selecionar ao lado do slot de protocolo. Clique em abrir para navegar e importar o protocolo para o software de agendamento. Insira o tempo de imagem necessário para a placa e clique em OK para fechar a janela.
Em intervalo, insira a frequência desejada de imagem, selecione programação, placa ou vaso para iniciar a sequência de validação da placa, clique em sim para aceitar essa agenda.
