Cepas de Shigella de três estrias em placas de ágar contendo corante vermelho Congo para garantir que as colônias sejam virulentas e para evitar o uso de colônias não virulentas em ensaios de infecção. Para começar, pegue as culturas Shigella cultivadas durante a noite e as vortexe. Adicione 100 microlitros da cultura a cinco mililitros de TSB fresco em um tubo de cultura.
Incubar as culturas a 37 graus Celsius enquanto agitam a 250 RPM até atingir uma densidade óptica de 0,7 a 600 nanômetros. Transfira 2 vezes 10 para as 8 unidades formadoras de colônias de Shigella subcultivadas para tubos de microcentrífuga de 2 mililitros. Células de pellet por centrifugação a 17.000 g durante dois minutos à temperatura ambiente.
Aspirar o sobrenadante. Adicione um mililitro de PBS morno e ressuspenda o pellet completamente. Depois de centrifugar a célula mais uma vez, ressuspenda o pellet em dois mililitros de DMEM quente e vortex a suspensão da célula.
Em seguida, adicione um mililitro de Shigella ressuspendida e um mililitro de DMEM a cada poço de monocamadas epiteliais colônicas HT29 em seis placas de poço. Para garantir o contato bacteriano com as células HT29, centrifugar as seis placas de poço a 2.000 g por 10 minutos à temperatura ambiente ou 37 graus Celsius. Incubar seis placas de poço a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 45 minutos.
Para determinar o título de infecção bacteriana, prepare diluições seriadas de dez vezes de células de Shigella ressuspensas em PBS. Placa de 100 microlitros das diluições 1 vezes 10 a 5 e 1 vezes 10 às 6 diluições em placas vermelhas Congo com TSB, e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. Após a incubação, aspirar o meio de cada poço.
Adicione um mililitro de PBS morno a cada poço e lave delicadamente. Em seguida, adicione dois mililitros de DMEM quente com 50 microgramas por mililitro de gentamicina e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Lave as células HT29 infectadas três vezes com um mililitro de PBS.
Adicione dois mililitros de DMEM quente com gentamicina a cada poço e incube por até 24 horas para replicação intracelular a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5%. No final da incubação, lavar as células duas vezes com um mililitro de PBS. Adicione um mililitro de PBS com 1% Triton X-100 a cada poço para lisar as células HT29.
Em seguida, usando um raspador de células ou ponta de pipeta dobrada, raspe as células lisadas do fundo do poço e transfira a mistura para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Vórtice cada tubo por pelo menos 30 segundos para deslocar Shigella das células eucarióticas lisadas. Preparar diluições seriadas dez vezes maiores dos lisados e PBS.
Placa de 100 microlitros das diluições em série em placas vermelhas de Congo com TSB, e incubar durante a noite a 37 graus Celsius.
